摘要
葡萄树干病害(GTDs)是葡萄种植者最关心的问题，因为它们不仅在数量上而且在质量上对葡萄园造成了相当大的损害。此外，在过去的三十年中，已经观察到这些真菌病理的社会经济影响的发生率越来越高。迄今为止，对于这些疾病还没有有效的控制战略或治疗方法，可以取代目前欧洲立法禁止的一系列化学合成杀菌剂所提供的有效性。在这种情况下，筛选不太敏感的品种被认为是一种可持续的gtd管理方法。在本文中提出的研究中，来自阿拉贡葡萄种质库(Movera, Zaragoza, Spain)的25个品种，包括商业、本地或少数种质，在露天条件下进行了离体扦插试验，测试了它们对两种与葡萄萎蔫菌相关的病原体(即Neofusicoccum parvum和Diplodia seriata)的耐药性/敏感性。根据8个月后病变长度的发展，不同品种间的内部(维管)坏死长度存在显著差异。总的来说，所有品种都对真菌感染敏感，但所研究的‘Macabeo’和‘Garnacha Tinta’生态型(来自萨拉戈萨的Villanueva de Huerva)分别是最不敏感的白色和红色品种。另一方面，‘Monegrina’、‘Grumel’和‘Torcijón’是最不耐真菌感染的品种。
介绍
在危害全球葡萄栽培生存能力和经济效益的不同病虫害中，葡萄树干病(GTDs)对种植园造成巨大损害，降低生产力，缩短植物的使用寿命(Serra等人，2021年)，相关的年度补种成本估计超过1.5亿美元(Hofstetter等人，2012年)。某些致病真菌引起的GTDs的共同之处在于，这些分类群对其寄生的木材产生内部改变，产生维管坏死、生长迟缓、叶面症状或根部腐烂等现象，导致植物在不确定的时期(1至30年)死亡，但通常很长(Luque i Font 2014)。近年来，除了与成年植物相关的经典病害外，还出现了一系列新的植物检疫问题，导致植物在种植后不久迅速衰退和死亡。据观察，种植第一年不发芽或死亡的植物比例不可忽略(Barrios i Sanroma等人，2004年)。目前，这类问题也给苗圃嫁接植株的生产带来了困难。影响幼苗(即小于8年树龄)的最常见的GTDs分别是黑足病、Petri病和Botryosphaeria dieback病。后者是影响主要葡萄酒产区葡萄园的最具破坏性和最广泛的疾病之一(Chacon等人，2020;Chacon-Vozmediano等人，2021)，以及在不同的botryosphaeriiaceae物种中(属于Botryosphaeria, Neofusicoccum, Diplodia, Lasiodiplodia, Dothiorella, Spencermartinsia和Sphaeropsis属(Gramaje等人，2018))-Neofusicoccum parvum (Pennycook和Samuels) croous, Slippers和A.J.L. Phillips (Laveau等人，2009;Úrbez-Torres等人，2006;Urbez-Torres 2011)和Diplodia seriata De Not (Rolshausen et al. 2010)是致病性研究中最常见的选择，因为前者毒性特别强，而且两者在木材定植方面都很快(Wallis 2021)。此外，它们的选择特别有趣，因为它们是多食性物种，宿主范围相当广泛，能够感染地中海地区的木本作物并引起类似症状，这些作物通常生活在葡萄园旁边(Sakalidis et al. 2013)。
这些疾病在过去几十年中显著增加(David Gramaje et al. 2018)被认为是几个因素的结果，包括禁止植物检疫产品(例如亚砷酸钠、苯并咪唑和甲基溴)，现代葡萄栽培采用了更集约的管理方法，以及对苗圃幼苗的需求增加(Mondello et al. 2018)。鉴于目前还没有针对这些疾病的完全有效的控制措施(David Gramaje et al. 2018)，有必要在害虫综合管理(IPM)框架下研究预防和控制策略，包括生物防治、苗圃植物检疫管理实践、培养方法和筛选自然抗性来源等。
特别是，使用抗性/耐受性品种是一种有吸引力和可持续的解决方案，可以限制这些疾病的影响，符合现行欧洲立法的标准(欧洲指令2009/128/EC第14条)。人们一致认为，这种策略将是控制这些真菌的最便宜、最简单、最安全、最环保和最有效的方法(Martinez-Diz et al. 2019;Chacon et al. 2020;Chacon-Vozmediano et al. 2021;David Gramaje et al. 2018)。
虽然目前还没有发现抗这些疾病的葡萄属种质(Bertsch et al. 2013)，但对于计划建立或重新种植葡萄园并希望减少对杀菌剂的依赖和管理GTD成本的葡萄酒种植者来说，了解葡萄品种对真菌树干疾病的抗性是必不可少的。在葡萄藤木材病害的一般情况下，几乎没有任何关于不同品种和/或商业常用砧木的耐受性/抗性程度的信息(Maldonado-González等人，2018)。尽管如此，一些植物材料对不同木材病害行为的证据已经被报道:例如，已经证实，“Riparai Glorie”砧木对黑足病敏感，而101-14 MGt砧木对这种真菌病理有更大的耐受性。此外，“Garnacha tinta”、“Cabernet Sauvignon”和“Syrah”等品种的赤霞珠病发病率更高，而“Merlot”、“Riesling”、“Pinot noir”、“Sauvignon blanc”、“Chardonnay”和“Semillon”对赤霞珠病(Eutypa lata)的耐受性更高。图尔。& C.Tul。感染。“长相思”(Sauvignon blanc)和“雷司令”(Riesling)白葡萄品种更容易出现与esca相关的叶面症状，而“白皮诺”(Pinot blanc)品种的症状较少。在红葡萄品种中，“雷博”品种更容易受到影响，而“西拉”和“梅洛”品种则较少出现与这种综合征相关的叶面症状。此外，嫁接在SO4上的品种比嫁接在1103 P上的品种表现出更高的与上述esca相关的症状发生率(Maldonado-González et al. 2018)。此外，“梅洛”、“马尔贝克”、“小维多”、“黑皮诺”、“霞多丽”和“雷司令”也会对各种GTDs表现出一定程度的耐受性(Ramirez等人，2018;Chacon-Vozmediano et al. 2021;Sosnowski et al. 2022)。
关于葡萄枯萎病，迄今为止已经鉴定出一些对葡萄枯萎病更耐的品种和砧木(Ramsing et al. 2021;Travadon et al. 2013;Billones-Baaijens et al. 2014;Chacon-Vozmediano et al. 2021;Chacon et al. 2020;Sosnowski et al. 2022;Serra et al. 2021;Ramirez et al. 2018;Guan et al. 2016)。例如，据报道，“Bobal”、“Monastrell”、“Macabeo”、“Moscatel serrano”、“Caíño Longo”、“Caíño Tinto”、“torrontsamos”、“Treixadura”和“Dona Branca”品种比其他品种更能抵抗N. parvum (Gramaje等人，2020;Chacon et al. 2020)。根据Sosnowski等人(2022)的研究，“Traminer”、“Sangiovese”和“gr
上述表型工作主要集中在病原真菌在栽培插枝或甘蔗上的机械人工接种(在实验室、温室或田间条件下)或对自然感染的现场观察(Chacon-Vozmediano et al. 2021)。考虑到后一种方法需要长期的研究，由于潜伏期和与叶片症状的可变和不连续行为相关的困难，在本文提出的研究中，选择第一种方法-使用先前检查过其植物检疫状态的藤芽-来筛选对gtd的天然抗性来源。本研究旨在通过对西班牙阿拉贡葡萄种质资源库(Movera, Zaragoza, Spain)的25个葡萄品种进行生根扦插致病性研究，评价其对两种病原菌(即小孢子虫N. parvum和seriata D. serata)的敏感性。选择这种方法有两个原因;一方面，从植物检疫的角度来看，从先前检查的实验葡萄园(视觉和微生物方法)生根的葡萄藤芽有可能获得未嫁接和健康的材料，另一方面，考虑到所选病原体(特别是小孢子虫)的侵略性和毒性，人们认为建立一个持续一次活动的生物测定是足够的。假设在此期间病原体的定殖率很高，并且在测试结束时对葡萄藤植物进行破坏性取样，以评估产生的内部坏死。这些品种——大多是从古老的葡萄园中恢复的——包括未知的、当地的和少数民族的品种;并不是所有的品种都获得了阿拉贡差异化质量标志(受保护的原产地名称，PDOs和受保护的地理标志，PGI)的种植许可，但他们的农艺行为和对疾病的易感性正在被积极研究，以评估所有这些文化遗产，并探索它们的遗传潜力，以识别负责某些表型性状的基因，或者像我们的情况一样，对gtd的耐受性。
材料与方法
植物材料
母株来自阿拉贡政府的种质资源库。具体来说，用于检测的葡萄藤木本嫩枝是从一个实验葡萄园中取样的，并由农业食品转移中心(CTA)(西班牙萨拉戈萨莫维拉)的葡萄藤技术和改进部门提供。
选取的25个品种分别为‘Macabeo’、‘Moscatel de Alejandría’(syn. =‘Moscatel de Málaga’)、‘Moscatel ang
还应该指出的是，对所研究的两种病原体筛选的品种集并不完全相同;造成这种情况的原因是插条总数的出芽不均匀，所以一些出芽率低的品种不得不全部接种这种或那种病原体。
每个品种在2021年12月修剪前剪下7个枝条。然后将芽切成至少20厘米长的片段，在5°C的低温室内保存，在最佳湿度条件下保存，直到种植。以前，对碎片进行目视检查，以确保它们没有与某些类型的木材病理学(存在血管坏死、部门腐烂、点蚀等)相关的症状，这些症状与人工接种的病原体或其他描述为最常见和最广泛的葡萄藤干病(GTDs)的病原相容。此外，对每个离体品种的无症状样本(4 - 5个获得的片段中直径约1cm，宽约0.5 cm的木片)进行表面消毒(EtOH 70% 1分钟，商用次氯酸钠溶液3% 4分钟，最后在无菌双蒸馏水中冲洗4 - 5次)。放置在添加了0.3 g/L硫酸链霉素的PDA平板上(以避免细菌污染)，在26°C的黑暗环境中培养3-10天，以分离和鉴定栖息在上述木材中的不同真菌内生菌，并丢弃与gtd相关的病原体。
真菌的分离和真菌接种物的生产
所选的葡萄球菌科真菌是一种从患病的阿拉贡葡萄植株中分离出来的小孢子虫和一种seriata菌株，保存在Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón中心(CITA, Zaragoza，西班牙)农业、森林和环境系统部真菌学实验室的活标本中。在- 80°C的温度下，用20%甘油从低温瓶中回收它们作为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)传代培养，对每个分离株进行周期性重复以保持最佳菌落。
插条生根试验
2022年3月，对葡萄藤插枝进行了人工接种。每个品种和病原菌安排7个重复(插枝)。在芽干上相距约10厘米的两点上接种所测试的病原体，尽管在某些情况下，由于节间或其他不规则现象的存在，这一距离较短，这使得不可能将伤口分开更远。每种真菌的新鲜3-5天PDA培养物的琼脂塞用作真菌接种物。切口(直径5毫米，深5毫米)是用手动咬痕器制作的。然后，将真菌定植的琼脂塞(直径3mm)放置在伤口上，用无菌双沸水浸湿的吸水棉覆盖，并用Parafilm胶带密封(图1)。
人工接种过程的详细情况:一株葡萄扦插了几个分析品种;B部分生物测定的概述;c圆形塞状真菌接种物的培养皿;d狭缝内嵌有d . seriata塞;E坏死长度估计
接种后，将插枝种植在萨拉戈萨大学(西班牙韦斯卡)Escuela politcnica Superior的滴灌地块上。每周对插枝进行目视观察，检查不同症状。接种8个月后，将扦插拔离地，切成片，纵向打开，评价木坏死的长度。在接种点两侧纵向上、下两个方向测量病变，取四次测量值的平均值作为每狭缝的坏死长度。病变间未见重叠。
统计分析
由于不满足正态性和均方差要求，因此采用Kruskal-Wallis非参数检验来检验品种间的差异。鉴于在5%显著性水平下发现显著性差异，对多个两两比较进行了具有Bonferroni校正的post - over - iman检验。Conover-Iman检验零假设在5%显著性水平下被拒绝。所有数据分析均使用R统计软件v. 4.2.2 (R Core Team 2022)，使用tidyverse (2.0) (Wickham et al. 2019)， rstatix (0.7.2) (Kassambara 2023)和conover进行。测试(1.1.5)(Dinno 2017)包。
目录
摘要 介绍 材料与方法 结果 讨论 结论 参考文献 致谢 作者信息 道德声明 补充信息 搜索 导航 #####结果
易感性联合国以及
根据所获得的结果(图S1，[补品])，应该注意的是，所分析的品种中没有一个对小孢子虫的感染具有耐受性。因此，接种病原菌后，所有品种都出现了或多或少的坏死长度。尽管如此，维管坏死的长度作为品种的函数存在统计学上的显著差异(Kruskal-Wallis检验p值< 0.0001)。如表1所示，“Garnacha Tinta”将是最具耐受性的品种，其次是“Macabeo”，“Moscatel ang
易感性d . seriata
对于seriata的易感性(图S2[补充])，也检测到具有统计学意义的差异(Kruskal-Wallis检验p值< 0.0001)(表2)。在这种情况下，“Santanera”、“Mazuela Ara-52”、“Cadrete”和“Macabeo”是最不易感的品种，其次是“Moscatel de Grano Menudo”和同样来自Villanueva de Huerva(萨拉戈萨)的“Garnacha Tinta”生态型对N. parvum表现出最好的行为。关于发现较大坏死的品种，它们包括两个' Parrel '生态型，' Grumel '， ' Monegrina '， ' Torcijón '，一个' Garnacha Tinta '生态型(来自萨拉戈萨Borja)， ' Gavina '和一个' Gonfaus '生态型(来自萨拉戈萨La Almolda)。在serata人工感染的情况下，中位坏死长度从5.6 mm(‘Santanera’品种)到57.2 mm(‘Monegrina’品种)不等。仅考虑白葡萄品种，中位长度值从前面提到的5.6毫米(“Santanera”品种)到48.1毫米(“Moscatel”品种)不等。当比较红葡萄品种时，中位长度从7.4毫米(‘Mazuela Ara-52’无品系)到上述57.2毫米(‘Monegrina’品种)不等。结果再次表明，同一品种的不同无性系，在对seriata感染的耐受性/敏感性方面表现出差异，例如品种Garnacha tinta、Parrel和Gonfaus。
讨论
尽管有越来越多的研究涉及葡萄品种对一些最重要和最广泛的gtd致病因子的天然抗性来源的筛选和开发，但其中大多数研究要么是基于全球分布的商业品种(Cardot等人，2019;Feliciano et al. 2004;Morales et al. 2012)，在某些情况下，来自特定葡萄酒种植区的本地或少数葡萄种质(Markakis et al. 2017)，甚至是两种品种的混合物(Foglia et al. 2022)。所测品种之间的这些差异，再加上不同病原制剂的使用，使得比较和推断研究结果变得非常困难。
总的来说，得到的结果表明，所分析的葡萄品种和基因型都不能完全耐受这两种病原体的感染，观察到它们的反应有梯度，反映在报告的坏死中位数长度的值上。通过这种方法，发现这些中间坏死长度值的变化从最敏感的品种到最耐受的品种是连续的，这证实了耐受反应存在定量遗传控制的假设，而不是一个主要的耐受基因。这与Martinez-Diz等人(2019)的报告一致，他们在一项关于不同品种对衣原孢子衣原体感染的敏感性的研究中(W. Gams, Crous, M.J. Wingf。Crous和W. Gams得出结论，在缺乏对这种和其他避免感染的gtd抗性的定性遗传控制的情况下，所有品种都可能易受感染，表现出敏感性/耐受性和症状表达的梯度，就像本研究的情况一样。此外，Lemaitre-Guillier等人(2020)在一项与某些葡萄品种对葡萄枯萎病的差异行为相关的代谢组学研究中表明，每种葡萄品种在某些植物化学物质和脂质的合成和表达的代谢途径中存在特定的模式，这加强了葡萄对这类真菌疾病的耐受性存在复杂和定量控制的假设。
如前所述，将这些结果与其他关于不同葡萄品种对几种GTD病原体的行为的研究结果进行比较时应谨慎对待，因为方法可能不同，而且其他因素，如植物材料年龄、分离毒力、品种组合、接种类型和数量或试验时间，都可能对确定抗病性产生影响。例如，Chacon-Vozmediano等人(2021)的研究仅基于在葡萄园中观察到的外部症状。在那项研究中，‘Garnacha Tinta’和‘Garnacha Tintorera’是29个品种中没有任何症状的品种，而在我们的研究中，‘Garnacha Tinta’的一个生态型名列最佳品种，但出现了症状。反过来，Macabeo是表现出症状的品种之一，但gtd症状不那么严重(与本文报道的结果一致)。在两项研究中分析的其他品种中，' Moscatel de Alejandría '在两项研究中都被确定为特别敏感;在他们的研究中，' ' Moscatel de Grano Menudo ' '没有表现出任何症状，并且在我们的分析中对D. seriata最不敏感;在拉曼查DO进行的试验中，一种‘Mazuela’品种(对seria D.最不敏感的品种)没有表现出症状。关于后一种品种，值得注意的是，它对白粉病特别敏感，因此，除了对gtd的敏感性外，葡萄酒种植者在选择种植品种时应考虑其他因素。这同样适用于其他品种(Cabello Sáenz de Santa María et al. 2019)。
关于品种对枯死菌相关真菌的敏感性研究，Chacón等人(2020)基于人工接种后坏死长度对西班牙红葡萄品种进行的另一项研究中，“Garnacha Tinta”对N. parvum表现出中等敏感性，但正如上文所述，该品种群体之间也发现了显著差异。Morales et al.(2012)对3个品种对几种枯枝孢霉相关真菌的敏感性进行了实地评估，发现所有品种对枯枝孢霉的感染同样敏感，但未发现对该病原体的自然感染完全耐受。Bellee等人(2017)在分子水平上研究了不同品种对不同葡萄球真菌(包括本文所分析的品种)人工感染的反应，发现根据所引起的病变，最具侵略性的小芽孢球菌(N. parvum)具有与其他病原体不同的代谢谱，因此，所有被测试的品种都没有表现出对其的耐受性，并且每个葡萄品种都呈现出不同的转录指纹。这反过来又与它在敏感性/耐受性方面的反应相关，加强了对GTD真菌感染反应的复杂控制的想法。
Ramirez等人(2018)在研究五种葡萄品种对seriata D.和Diplodia mutila Fries人工感染的敏感性时，发现(和我们的情况一样)所有品种对病原体的作用都很敏感，在产生血管病变的范围内呈梯度。
此外，在Sosnowski等人(2022)进行的一项广泛研究中，研究人员对174个葡萄品种进行了对叶裂霉和系列裂霉的敏感性的视野估计，然后选择品种进行离体插枝接种，报告了对后者真菌感染敏感性的分级。虽然没有发现任何品种的完全耐受性，但“Muscadelle”品种(与本研究中分析的不同muscatel密切相关的白葡萄品种)被认为是最耐受性的品种之一。
回到Martinez-Diz等人(2019)的研究结果，衣孢单胞菌在“Garnacha Tintorera”中引起的病变长度很高，这与这里观察到的来自萨拉戈萨Borja的“Garnacha Tinta”生态型的行为一致。这些作者还指出，在EVEGA试验中，“Moscatel Grano Menudo”是对衣孢单胞菌最不敏感的品种之一，这与我们的结果很好地吻合。
最后，关于本研究中存在的几种具有相同蛇形学特征但不同地理来源的物种，在对人工感染的反应(就坏死中位数长度而言)方面存在一定的变异性。在这方面，应该指出的是，‘Parrel’和‘Gonfaus’等品种构成了一个例子，即在没有受到选择压力和没有进行植物育种计划的老品种中，可能存在许多循环无性系，其中大多数是群体变异。换句话说，这些品种的类型化概念是基于这些生态型中存在广泛的品种内多样性，这些生态型在保持品种特性的同时，提供了农艺性状、产量、酿酒技术和抗病性方面的遗传变异(Balda和Martínez de Toda 2017)。
结论
在本研究中，为了筛选对某些葡萄萎蔫菌(Botryosphaeria dieback fungi)的天然抗性来源，我们在露天条件下对25个来自阿拉贡葡萄种质库(Grapevine Germplasm Bank of Aragon)的品种进行了人工接种。没有鉴定出对小恙螨或系列恙螨具有完全抗性的品种。这些结果与先前鉴定对gtd病原菌的抗性的努力一致，其中没有发现对不同物种感染具有完全耐受性的植物材料。然而，在某些品种中发现了一定程度的耐受性，因为在坏死长度上观察到显着差异。从这个意义上说，结果表明Macabeo和Garnacha Tinta生态型(来自萨拉戈萨Villanueva de Huerva)分别是最不敏感的白色和红色品种。报告的信息可以帮助有兴趣的葡萄酒种植者减少对杀菌剂的依赖，并通过促进他们为新葡萄园选择植物材料来控制gtd的成本。
补充信息
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