摘要

厌氧、产醋酸细菌是很有前途的生物催化剂，因为它们能捕获二氧化碳并将其转化为乙酸。氢是有机和C1底物形成乙酸的中间物。在这里，我们分析了模型醋酸杆菌woodii的突变体，其中两种氢化酶中的一种或两者都被基因删除。在双突变体的静息细胞中，由果糖生成的氢被完全消除，碳被重定向到乳酸。乳酸/果糖和乳酸/乙酸比值分别为1.24和2.76。然后我们测试了甲基(从甘氨酸甜菜碱中提取)和一氧化碳形成的乳酸。事实上，同样在这些条件下，乳酸和乙酸也以等摩尔量形成，乳酸/乙酸比为1.13。当电子分叉乳酸脱氢酶/ETF复合物被基因删除时，乳酸形成被完全取消。这些实验证明了伍迪草可以从果糖中产生乳酸，也可以从有前途的C1底物、甲基和一氧化碳中产生乳酸。这为从二氧化碳到增值化合物的价值链的形成增添了一个重要的里程碑。

要点

•woodii醋酸杆菌ΔhydBA/hdcr突变体的静息细胞从果糖或甲基+ CO中产生乳酸

•删除lctBCD后，甲基+ CO生成乳酸被完全消除

•均质乙素到乳酸形成的代谢工程具有工业应用的潜力

介绍

产醋细菌是一组严格意义上的厌氧细菌，它们将一摩尔己糖(如果糖)氧化为三摩尔醋酸盐，这种代谢特性被称为同质产醋(Fontaine et al. 1942)。果糖通过embden - meyerhoff - parnas途径被氧化为4个电子和2 mol丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化为2 mol乙酰辅酶a、CO2和另外4个电子(Ragsdale 2003)。乙酸形成每己糖产生4 mol ATP，这是通过发酵可以获得的最高ATP量(m ller 2008;m ller and Frerichs 2013)。这只能通过在二氧化碳还原为乙酸的特殊途径中处理电子来实现，Wood-Ljungdahl途径(WLP)，其中两个二氧化碳被八个电子还原为乙酸(m ller 2003;Wood and Ljungdahl 1991)。WLP不仅是果糖氧化的电子池，而且还允许在H2 + CO2上生长(Schuchmann and m ller 2014;Wood et al. 1986)或其他C1化合物，如甲酸酯(Moon et al. 2021)或甲醇(Balk et al. 2003;Kremp and m 勒2021;Kremp et al. 2018;van der Meijden et al. 1984)。二氧化碳在两个分支中被还原。在甲基分支中，一个二氧化碳首先被甲酸脱氢酶还原为甲酸，或者更具体地说，在模型醋酸菌中，由氢依赖的二氧化碳还原酶还原为甲酸(Schuchmann and m ller 2013)。甲酸然后在依赖atp的反应中与C1载体四氢叶酸(THF)结合(Himes和Harmony 1973;Lovell et al. 1988)，生成甲酰基四氢呋化物，其中水被除去，产生的甲基四氢呋化物通过亚甲基还原为甲基四氢呋化物(Bertsch et al. 2015;Ragsdale and Ljungdahl 1984)。在第二个分支中，CO2被还原为CO，然后与该途径的关键酶CO脱氢酶/乙酰辅酶a合成酶(CODH/ACS)结合，并与甲基和辅酶a结合成乙酰辅酶a (Ragsdale 2008)。底物甲酸酯(Moon et al. 2021)和一氧化碳(Diekert and Thauer 1978;Diender et al. 2015;Genthner and Bryant 1982;Weghoff and m ller 2016)是该途径的中间体，来自甲醇或甜菜碱的甲基通过甲基转移酶系统进入该途径，产生甲基- thf (Kremp and m ller 2021;Kremp et al. 2018;Lechtenfeld et al. 2018)。

近年来，由于产醋酸菌捕获温室气体二氧化碳并将其还原为醋酸盐，因此引起了人们的极大兴趣。这种小链脂肪酸本身的应用有限，但从长远来看，醋酸盐可能会取代葡萄糖，成为可持续生物经济的原料，不仅可以生产生物燃料，还可以生产目前由糖生产的所有其他产品，例如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌或酵母(Förster and Gescher 2014;Ingram et al. 1987;Inui等人，2004a, b;Jojima等，2015a, b;Lim et al. 2018;Mohd Azhar et al. 2017)。除醋酸盐外，一些乙酸可以从C1化合物(如CO2和CO)中生产乙醇，这一过程已经在工业规模上使用(Liew等人，2017,2022;Mock et al. 2015)。高碳化合物很少产生，而且通常不是由C1化合物产生的。感兴趣的C1底物是甲醇，它也被丙酮用作碳和能源(Kremp和m ller 2021;Kremp et al. 2018;van der Meijden et al. 1984)。甲醇已经在工业水平上由二氧化碳化学产生，甲醇作为原料的使用规避了气体发酵所固有的所有问题。

最近，我们在伍迪草中发现了一种新的代谢特性，果糖的混合酸发酵(Moon et al. 2023a)。WLP的中心酶亚甲基四氢叶酸还原酶基因缺失的突变体能够在果糖上生长。但醋酸盐并不是唯一的产品;此外，最终产物为氢分子、甲酸酯、乙醇和乳酸(Moon et al. 2023a)。这一发现为改造菌株提供了可能，这些菌株可以将果糖甚至C1化合物转化为减少的最终产物，如乙醇或乳酸盐。乳酸的生产非常有趣，因为它广泛用于食品，制药和化妆品行业，以及作为生物可降解塑料聚乳酸(PLA)的前体(Ahmad et al. 2022)。在这里，我们选择乳酸作为目标，并产生了一种菌株，该菌株通过果糖或甲基加一氧化碳进行异乳酸发酵。

材料与方法

菌种与培养

乌地弓形虫野生型(DSM1030)来自德国微生物和Zellkulturen (DSMZ;德国布伦瑞克)。∆pyrE菌株已在之前描述过(Wiechmann et al. 2020)。最近描述了hdcr缺失突变体∆hdcr和双突变体∆hydBA/hdcr (Moon et al. 2023b)。本研究还产生了三突变体∆hydBA/hdcr/lctBCD，其中编码乳酸脱氢酶的基因被删除。如前所述，在30°C的缺氧条件下，在碳酸氢盐缓冲的复合培养基中常规培养所有菌株(Heise et al. 1989)。生长底物为60 mM果糖+ 100 mM甲酸盐，或50 mM甜菜碱+ 10% CO。通过测定600 nm光密度(OD600)来监测生长情况。

一代的A.伍迪ΔhydBA/hdcr/lctBCD突变体

为了产生ΔhydBA/hdcr/lctBCD三重突变体，在大肠杆菌HB101 (Promega, Madison, WI, USA)中构建质粒pmtl84151_lw_dct，并将其转化为A. woodii ΔhydBA/hdcr菌株(Moon et al. 2023b)，如前面所述(Westphal et al. 2018)。质粒pmtl84151_lw_dct源自pMTL84151 (Heap et al. 2009)，但缺乏革兰氏阳性复制子。在pmtl84151_lw_dct中，将lctB (Awo_c08710)的1000 bp上游侧翼区(UFR)和lctD (Awo_c08730)的1000 bp下游侧翼区(DFR)克隆到多个克隆位点上，通过同源重组来删除lctBCD基因。质粒还具有产气荚膜梭菌编码氯霉素/硫霉素耐药的catP标记(Werner et al. 1977)和来自石灰真杆菌(Eubacterium limosum)的异源pyrE基因(Wiechmann et al. 2020)作为反选择标记。将pmtl84151_lw_dct电穿孔转化为A. woodii ΔhydBA/hdcr菌株(625 V, 25µF, 600 Ω， 1 mM比皿)后，在含有20 mM果糖+ 50 mM甲酸盐和30 ng/µl硫霉素的复合培养基上进行首次筛选。第二次筛选在琼脂平板上进行，培养基中含有20 mM果糖+ 50 mM甲酸盐，1µg/ml尿嘧啶和1 mg/ml 5-氟硼酸盐(5-FOA)。对缺失区域进行PCR分析，引物结合UFR上游和DFR下游:aus_lct_for(5′-CAGGCAATGTTTTTTAATGTCAGGA-3′)和aus_lct_rev(5′-ATAACTTTTGCCAAAGCCACAAT-3′)。因此，通过PCR实验验证突变体的纯度，引物结合在lctD基因上:in_lct_for (5 ' - ggtaatatcagtacgaatgccgg -3 ')和in_lct_rev (5 ' - gaatcgccttggattttaatatatcttcg -3 ')。随后，通过DNA测序验证突变体缺失区域的序列(Sanger et al. 1977)。

静息细胞的制备

在1 l碳酸氢盐缓冲的复合培养基中，分别用60 mM果糖+ 100 mM甲酸盐或50 mM甘氨酸甜菜碱+ 10% CO培养细胞至指数生长后期(60 mM果糖+ 100 mM甲酸盐，OD600为1.5;50mm甘氨酸甜菜碱+ 10% CO, OD600 = 0.7)。离心收获细胞(Avanti J-25和JA-10定角转子;Beckman Coulter, Brea, CA, usa)， 8000 rpm, 4°C, 10 min，用30 ml含有50 mM咪唑(pH 7.0)， 20 mM KCl, 20 mM MgSO4, 4 mM DTE和4µM resazurin的缓冲液洗涤，并在8500 rpm, 4°C离心10 min (Avanti J-25和JA-25.50固定角转子;贝克曼库尔特，布雷亚，加州，美国)。随后，将微球重悬于5ml咪唑缓冲液中，并转移到16ml Hungate管中。所有步骤在缺氧室(Coy实验室产品，Grass Lake, MI, United States)中严格缺氧条件下进行，充满N2/H2 (96-98% / 2-4%;v / v)。为了去除缺氧腔中残留的H2，将细胞悬浮液的气相改为100% N2。如前所述，测定细胞悬液的总蛋白浓度(Schmidt et al. 1963)。

细胞悬浮实验

对于果糖发酵，将细胞在120 ml血清瓶中，在N2/CO2气氛(80:20,v/v)下，用20 ml含咪唑缓冲液(50 mM咪唑，20 mM KCl, 20 mM NaCl, 20 mM MgSO4, 60 mM KHCO3, 4 mM DTE, 4µM resazurin, pH 7.0)重悬至最终蛋白浓度为2 mg/ml。添加60 mM果糖作为底物。对于甘氨酸甜菜碱+ CO发酵，在N2/CO2/CO气氛(2 bar, 72:18:10, v/v/v)下，将静息细胞置于10 ml含咪唑的碳酸氢盐缓冲液中，至最终蛋白浓度为1 mg/ml。贫碳酸氢盐条件下的实验，使用贫碳酸氢盐缓冲液(50 mM咪唑，20 mM KCl, 20 mM NaCl, 20 mM MgSO4, 4 mM DTE, 4µM resazurin, pH 7.0)，将气相换成N2/CO气氛(2 bar, 90:10, v/v)。在Na+耗尽条件下的实验中，使用Na+耗尽缓冲液(50 mM咪唑，20 mM KCl, 20 mM MgSO4, 60 mM KHCO3, 4 mM DTE, 4µM resazurin, pH 7.0)，并根据供应商的说明使用Orion 84-111 ROSS钠电极(Thermo Electron, Witchford, UK)测定缓冲液中污染的Na+浓度。在静息细胞中加入50mm甜菜碱作为底物。静息细胞在30°C的水浴中振荡(150 rpm)预孵育，加入底物开始实验。实验过程中，常规取1 ml样品进行代谢物分析。

我tabolite分析

如前所述，采用高效液相色谱法测定果糖、甲酸盐、乙酸盐和乳酸盐的浓度(Moon et al. 2019)。气相色谱法分析H2或乙醇(trifunnoviki et al. 2016;Weghoff and m ller 2016)。

基因的前女友压力分析

在碳酸氢盐缓冲的复合培养基中，在N2/CO2/CO气氛(72:18:10,v/v/v)下，在50 mM甘氨酸甜菜碱上生长的∆pyrE，∆hdcr，∆hydBA/hdcr突变体在指数生长阶段收获。RNA和cDNA的制备如前所述(Dönig and m ller 2018)。按照供应商的说明，在Rotor Gene RG-3000 qPCR循环器(Corbett Research, Cambridge, UK)上使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)使用实时qPCR分析lctB、lctC和lctD基因的转录水平。以内参基因gyrA (Awo_c00060)为参照，采用2−ΔΔCt方法计算相对基因表达量(Livak and Schmittgen 2001)。扩增使用以下引物:lctB用qlctB_for(5′-GCGCTGATGAGGGTTGTTTA-3′)和qlctB_rev(5′- gtccaatcgtttggtg -3′)，lctC用qlctC_for(5′-GTCGATCATATTGAAGGCCAGAT-3′)和qlctC_rev(5′-ACAAGGCATAAACCGGATGT-3′)，lctD用qlctD_for(5′-GATTCCAACGGCGATTGAAT-3′)和qlctD_rev(5′-TATAAGCGTTGCTACTGGAGTC-3′)。

目录

介绍 材料与方法 结果 讨论 数据可用性 参考文献 作者信息 道德声明 搜索 导航 ＃＃＃＃＃

结果

应变设计

woodii的基因组中编码有两种氢化酶，HDCR的HydA2亚基和电子分叉的HydABC氢化酶(Poehlein et al. 2012);两者都被单独或串联删除(Moon et al. 2023b;Wiechmann et al. 2020)。在乌地弓形虫中只有一种已知的乳酸脱氢酶，即由lctBCD (Awo_c08710 - Awo_c08730)编码的电子分岔LDH/ETH复合物(Poehlein et al. 2012)。众所周知，这种酶复合物在伍迪草对乳酸的生长过程中负责乳酸氧化(Weghoff et al. 2015)。最近，有报道称lctBCD基因在果糖上生长的ΔmetVF突变体中高度表达，其中乳酸是作为副产物形成的(Moon et al. 2023a)。因此，为了验证可能的乳酸形成确实是由LctBCD催化的，我们从基因上删除了LDH/ETF复合物。为了生成ΔhydBA/hdcr/lctBCD突变体，我们构建了自杀质粒pmtl_84151_lw_dct，该质粒每1000 bp包含lctB的上游侧翼区(UFR)和下游侧翼区(DFR)，只留下lctB的起始密码子和lctD的停止密码子(图1a)。为了进行选择，该质粒携带了来自石灰真杆菌(Wiechmann et al. 2020)的pyrE基因和产气荚膜梭菌(Werner et al. 1977)的氯霉素/硫霉素耐药盒(catP)。质粒在巯基苯酚存在下通过同源重组整合到ΔhydBA/hdcr突变体的染色体上，随后用5-氟代酸反选择进行解体。以果糖+甲酸盐作为碳源和能量源，在琼脂平板上采摘单个菌落。在缺失区外结合引物的PCR实验显示，lctBCD基因被成功删除(图1b)，在lctD内结合引物无法扩增lctD基因(图1c)。随后，通过DNA测序证实了染色体中lctBCD基因的缺失(Sanger et al. 1977)。

ΔhydBA/hdcr突变体染色体上lctBCD基因的缺失。(a)利用质粒pMTL_LW_dlct缺失lctBCD基因后的遗传组织。在ΔhydB/hdcr/lctBCD突变体中只保留了3bp的lctB基因和3bp的lctD基因。利用集落PCR对ΔhydBA/hdcr/lctBCD突变体进行基因型分析，引物结合在缺失区(b)外(aus_lct_for和aus_lct_rev)或缺失区(c)内(in_lct_for和in_lct_rev)。

异乳酸发酵用果糖在∆hydBA / hdcr双突变体

在之前的一项研究中，我们发现在a . woodii的ΔmetVF突变体中，果糖转化为氢分子、甲酸酯、乙醇和乳酸作为最终产物(Moon et al. 2023a)。在这里，我们的目标是将果糖代谢转向乳酸。由于乙醇的产量非常少，而且伍地蒿有11种不同的乙醇脱氢酶，因此没有试图从基因上删除乙醇的产量。氢气产生了大量(Moon et al. 2023a)，因此我们分析了∆hdcr和ΔhydBA/hdcr双突变体中氢气的产生是否会被消除。这些突变体的生长表型以前已经被描述过;简而言之，它们不能在果糖、H2 + CO2、甲醇或甲酸盐上生长(Moon et al. 2023b)。因此，突变体生长在果糖+甲酸盐上，在指数生长阶段收获，然后分析静息细胞中果糖的发酵平衡。由于我们已经看到高浓度的糖在某些条件下刺激了还原性终产物乙醇的产生(Moon and m ller 2021)，我们用60毫米而不是20毫米的果糖进行了实验。

在∆hdcr突变体的静息细胞中添加果糖，消耗21.4±1.4 mM果糖，生成21.0±0.4 mM乙酸，果糖与乙酸的比例为1:1(图2a)。甲酸盐没有像预期的那样产生。正如之前在ΔmetVF突变体(Moon et al. 2023a)中看到的那样，在果糖:H2比例为1:2.1的情况下，氢气仍然大量形成(45.4±2.2 mM)。乙醇(1.5±0.0 mM)和乳酸(2.1±0.9 mM)只形成非常少量。由于电子明显以氢的形式释放，我们在∆hdcr背景下检查氢化酶HydABC缺失的影响。在∆hydBA/hdcr突变体的静息细胞中，氢的生成完全停止，31.1±1.1 mM果糖产生的乙酸(14.0±2.5 mM)减少，果糖与乙酸的比例仅为1:0.45(图2b)。当果糖与乙醇的比例为1:0.14和乙酸与乙醇的比例为1:0.32时，乙醇的形成略有增加(4.5±0.6 mM)。相比之下，乳酸产量从几乎为零急剧增加到38.6±2.1 mM，果糖:乳酸比为1:1.24，醋酸:乳酸比为1:2.76。

梧桐静息细胞中果糖的转化。Δhdcr (a)、ΔhydBA/hdcr (b)和ΔhydBA/hdcr/lctBCD突变体(c)的细胞在碳酸氢盐缓冲的复合培养基中生长，在N2/CO2气氛(80:20,v/v)中加入60 mM果糖+ 100 mM甲酸盐，并在早期固定生长阶段收获。细胞悬液取10 ml细胞悬液缓冲液(50 mM咪唑，20 mM MgSO4, 20 mM KCl, 20 mM NaCl, 60 mM KHCO3, pH 7.0)，置于120 ml血清瓶中，在N2/CO2气氛下制备，最终蛋白浓度为2 mg/ml。给予细胞悬浮液60 mM果糖作为碳源和能量源。测定果糖(●)、乙酸(■)、乙醇(▲)、甲酸酯(▼)、H2(♦)和乳酸(x)。每个数据点代表一个具有标准差(SD)的平均值;N = 2个独立实验

由于lctBCD基因是唯一被注释编码乳酸脱氢酶的基因(Poehlein et al. 2012)，我们预计三元突变体∆hydBA/hdcr/lctBCD会完全丧失乳酸生成并增加乙醇产量。然而，没有观察到这一点。与双突变体相比，乳酸产生的滞后期更长，约为8小时，但乳酸产生的速率和产量与双突变体相似(图2c)。

由甘氨酸、甜菜碱和一氧化碳形成乳酸

接下来，我们分析了细胞是否会从C1化合物中产生乳酸。野生型木犀草生长在甲醇+ CO上，甲醇+ CO转化为乙酸;甲基和CO是WLP的中间体，它们被CODH/ACS凝聚成乙酰辅酶a (Litty et al. 2022)。HDCR不参与新陈代谢。由于无论是否存在CO，∆hdcr和∆hydBA/hdcr突变体都不能在甲醇上生长(Moon等人，2023b)，因此我们测试了在另一种含甲基的底物甘氨酸甜菜碱上的生长，该底物可被伍地弓形虫用作碳和能量来源(Lechtenfeld等人，2018)。我们最近发现，∆hdcr和∆hydBA/hdcr突变体在甘氨酸甜菜碱上生长，并与乙酸一起产生甲酸作为最终产物(Moon et al. 2023b)。甜菜碱作为甲基供体，二甲基甘氨酸由细胞排出(Lechtenfeld et al. 2018)。∆pyrE以及∆hdcr、∆hydBA/hdcr、∆hydBA/hdcr/lctBCD突变体在50 mM甘氨酸甜菜碱+ CO上生长良好，仅产生乙酸(∆pyrE, 47.5±1.3 mM;∆hdcr, 46.6±2.1 mM;∆hydBA/hdcr, 44.9±1.8 mM;∆hydBA/hdcr/lctBCD, 45.5±0.6 mM)，与在甲醇+ CO上的生长相似(Litty et al. 2022)(图3)。然后，我们检查了静息细胞中产物的形成。∆pyrE菌株的静息细胞从50 mM甘氨酸甜菜碱和CO中产生50.9±1.6 mM乙酸(图4a)， HDCR突变体(48.2±1.0 mM)也是如此(图4b)，正如预期的那样。细胞产生氢气(两种菌株均为0.5 mM)，最有可能来自CO氧化。CO氧化与铁氧还蛋白的还原相耦合，随后分两步产生分子氢:首先，还原的铁氧还蛋白被Rnf复合物再氧化(与NAD的还原)(Hess et al. 2013)，然后电子分叉氢化酶从还原的铁氧还蛋白和NADH形成氢(Schuchmann and m ller 2012)。因此，我们推断，电子分叉氢化酶的缺失应该将电子重定向到另一个受体。事实上，∆hydBA/hdcr双突变体的静息细胞不再产生H2，而是产生乳酸，同时产生乙酸(图4c)。醋酸盐的生产速度略快，但最终醋酸盐和乳酸盐浓度相似。由50 mM甜菜碱+ CO，形成18.1±1.1 mM醋酸盐和20.4±0.5 mM乳酸盐，乙酸与乳酸的比例为1:1.1。作为次要产物，我们还检测到2.5 mM乙醇。与乳酸产量一致，我们发现，在甜菜碱+ CO发酵过程中，∆hydBA/hdcr突变体中的lctBCD基因高度上调(图5)。与∆pyrE菌株相比，∆hydBA/hdcr突变体中的lctB基因上调了log2倍，变化幅度为9.9±0.6。lctC基因的log2倍变化为10.0±0.2,lctD基因的log2倍变化为11.0±0.3。乳酸一定是由乙酰辅酶a通过丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)羧化成丙酮酸形成的，事实上，与富含二氧化碳/碳酸氢盐的条件(参见图4c)相比，在缺乏二氧化碳/碳酸氢盐的条件下(图6a)观察到乳酸的形成减少。由于LDH/ETF复合体生产乳酸需要NADH，因此Rnf复合体必须参与其中，即乳酸生产必须依赖Na+。事实上，在没有NaCl的情况下，乳酸的产生(参见图4c)完全消失，∆hydBA/hdcr突变体只产生乙酸(44.0±1.8 mM)(图6b)。

甘氨酸甜菜碱+ CO对木犀草菌株生长的影响。生长实验在含有50 mM甘氨酸甜菜碱的120 ml血清瓶中，在30°C N2/CO2/CO气氛(72:18:10,v/v/v)中，用20 ml碳酸氢盐缓冲的复合培养基进行。所描绘的是∆pyrE(●)、∆hdcr(■)、∆hydBA/hdcr(▲)和∆hydBA/hdcr/lctBCD突变体(▼)的光密度。此外，在生长过程中测定乙酸(开放符号)。每个数据点表示平均值±SD;N = 2个独立实验

梧桐静息细胞中甘氨酸甜菜碱+ CO的转化。ΔpyrE (a)、Δhdcr (b)和ΔhydBA/hdcr突变体(c)的细胞在含有50 mM甘氨酸甜菜碱的N2/CO2/CO气氛(72:18:10,v/v/v)的碳酸氢盐缓冲的复合培养基中生长，并在早期固定生长阶段收获。在含50 mM甜菜碱的120 ml血清瓶中，加入10 ml细胞悬液缓冲液(50 mM咪唑，20 mM MgSO4, 20 mM KCl, 20 mM NaCl, 60 mM KHCO3, pH 7.0)，在2 bar的N2/CO2/CO (72:18:10, v/v/v)气氛下制备细胞悬液，最终蛋白浓度为1 mg/ml。测定乙酸(●)和乳酸(▲)。每个数据点表示平均值±SD;N = 2个独立实验

测定ΔhydBA/hdcr突变体在甘氨酸甜菜碱+ CO环境下生长过程中lctB、lctC和lctD基因的转录水平。在N2/CO2/CO气氛(72:18:10,v/v/v)下，用50 mM甘氨酸甜菜碱培养的∆pyrE、Δhdcr和ΔhydBA/hdcr突变体合成cDNA。采用实时荧光定量PCR技术分析Δhdcr(灰条)和ΔhydBA/hdcr(黑条)突变体中lctB、lctC和lctD基因的转录水平，并将相对表达归一化为家养基因gyrA。以∆pyrE菌株cDNA为对照(白色条)。每个数据条表示平均值±SD;N = 3个独立实验

(a) CO2/HCO3−-或(b) Na+枯竭条件下ΔhydBA/hdcr突变体静息细胞中甜菜碱+ CO的转化。ΔhydBA/hdcr突变体的细胞在碳酸氢盐缓冲的复合培养基中生长，在N2/CO2/CO气氛(72:18:10,v/v/v)中添加50 mM甘氨酸甜菜碱，并在早期固定生长阶段收获。在含50 mM甜菜碱的120 ml血清烧瓶中，在2 bar (a) N2/CO (90:10, v/v)或(b) N2/CO2/CO (72:18:10, v/v/v)气氛下，用10 ml (a)碳酸氢盐缺失(50 mM咪唑，20 mM MgSO4, 20 mM KCl, 20 mM NaCl, pH 7.0)或(b) Na+缺失的细胞悬浮液缓冲液(50 mM咪唑，20 mM MgSO4, 20 mM KCl, 60 mM KHCO3, pH 7.0)制备细胞悬液，最终蛋白浓度为1 mg/ml。污染的Na+浓度为0.1 mM，测定了乙酸(●)和乳酸(▲)。每个数据点表示平均值±SD;N = 2个独立实验

在∆hydBA/hdcr/lctBCD三重突变体中，乳酸的生成几乎完全被消除(图7)，这表明乳酸是由电子分岔的LDH/ETF复合物产生的。有趣的是，ΔhydBA/hdcr/lctBCD突变体产生的乙醇量是ΔhydBA/hdcr突变体的两倍(6.0±0.2 mM)，这表明在缺乏LDH/ETF复合物的情况下，电子部分转移到乙醇生产。

在ΔhydBA/hdcr/lctBCD突变体的静息细胞中，甜菜碱+ CO生成的乳酸被消除。ΔhydBA/hdcr/lctBCD突变体的细胞在碳酸氢盐缓冲的复合培养基中生长，在N2/CO2/CO气氛(72:18:10,v/v/v)中添加50 mM甘氨酸甜菜碱，并在早期固定生长阶段收获。在含50 mM甜菜碱的120 ml血清瓶中，加入10 ml细胞悬液缓冲液(50 mM咪唑，20 mM MgSO4, 20 mM KCl, 20 mM NaCl, 60 mM KHCO3, pH 7.0)，在2 bar的N2/CO2/CO (72:18:10, v/v/v)气氛下制备细胞悬液，最终蛋白浓度为1 mg/ml。测定乙酸(●)和乳酸(▲)。每个数据点表示平均值±SD;N = 2个独立实验

讨论

产醋细菌是将我们的生物经济转变为可持续的无糖生物经济所需的生物催化剂的主要候选者。这组细菌不需要氧气，在严格的缺氧条件下很容易处理，即使在工业规模的发酵罐中也能生长健壮，并且可以使用一氧化碳(Diekert和Thauer 1978;Diender et al. 2015;Genthner and Bryant 1982;Savage et al. 1987;Weghoff and m ller 2016)，或更多还原的C1化合物，如甲酸酯(Moon et al. 2021)，或从各种甲基供体中衍生的甲基，如甲醇或甘氨酸甜菜碱，作为乙酰辅酶a的组成部分(Kremp and m ller 2021;Kremp et al. 2018;Lechtenfeld et al. 2018;Litty et al. 2022;van der Meijden et al. 1984)。用于还原的电子可以从氢分子、一氧化碳或有机底物如糖的氧化中得到。此外，许多酵素可以在糖和氢分子上混合营养生长，从而增加了零碳排放技术的潜力(Schuchmann and m ller 2016)。

虽然醋酸是所有醋酸的主要产物，但有些可以自然地产生还原的最终产物，如C1化合物的乙醇(Abrini et al. 1994;Köpke et al. 2010;Wilkins and Atiyeh 2011)。从C1化合物中很少观察到乳酸的产生。乳酸是一种具有重要工业价值的化合物，因为它是PLA的前体(Ahmad et al. 2022)。伍迪是目前研究最多的一种醋酸菌，不仅对WLP的生物化学和生物能量学进行了详细的研究，而且对C1底物进入WLP的代谢途径(如甲醇、甘氨酸甜菜碱或CO)也进行了详细的研究(Kremp and m ller 2021;Schuchmann and mller 2014)。最近，我们发现一种亚甲基- thf还原酶缺失突变体可以进行混合酸发酵，并与其他发酵产物一起产生乳酸(Moon et al. 2023a)。在这里，我们使用基因工程菌株，∆hdcr和∆hydBA/hdcr突变体进一步研究乳酸产量。当电子分叉氢化酶被删除后，果糖发酵的主要产物是乳酸，这意味着糖酵解过程中产生的电子被用于生产乳酸。出乎意料的是，∆hydBA/hdcr/lctBCD突变体仍然产生乳酸，尽管在基因组中没有发现其他ldh基因。有趣的是，在一些微生物中，依赖NAD+的LDH需要果糖-1,6-二磷酸(糖酵解的一种中间体)来催化活性(Arai等人，2002;Brown and Wittenberger 1972;Freier and Gottschalk 1987;Machida et al. 1985a, b).在三重突变体中，果糖-1,6-二磷酸可能由于果糖转化缓慢而积累，并触发另一种未知LDH的形成/激活。但是在果糖发酵过程中也有另一种产生乳酸的方法。糖酵解的中间体，二羟丙酮磷酸(DHAP)可以转化为甲基乙二醛，并进一步还原为乙醛。然后，可以将乙醛再氧化为乳酸(Bhowal等，2020;Stewart et al. 2013)。woodii的基因组编码可能催化这些反应的酶(Poehlein et al. 2012)。然而，这种方法不能再氧化糖酵解形成的还原性等价物。双突变体究竟如何从果糖中产生乳酸，必须通过进一步的突变体分析来研究。值得注意的是，LDH/ETF复合物的缺失消除了C1化合物的乳酸形成(见下文)，这表明需要(部分)糖酵解来触发LDH的替代方式。

从C1化合物中生产乳酸盐是生物技术应用中最具吸引力的。最近，一种lctBCD缺失突变体伍氏弓形虫携带来自肠系膜Leuconostoc的乳酸脱氢酶基因融合到荧光激活和吸收转移标签蛋白(FAST)中，被证明可以从H2 + CO2中产生乳酸(Mook et al. 2022)。在批量实验中，该菌株从H2 + CO2中产生18.8 mM乳酸，但乳酸是副产物，乳酸/乙酸比为0.33 (Mook et al. 2022)。为了探索更多还原C1化合物的乳酸生成，我们选择甘氨酸甜菜碱作为甲基供体加上CO作为底物。如前所述，对于甲醇+ CO (Litty et al. 2022)，∆pyrE菌株的静息细胞仅从甘氨酸甜菜碱+ CO中产生乙酸，根据:

(1）

图8描述了∆hydBA/hdcr突变体中甘氨酸甜菜碱+ CO生成乳酸的可能情况。甜菜碱的甲基首先通过甲基转移酶体系转化为四氢呋喃，生成甲基四氢呋喃，然后在CODH/ACS络合物上与CO和CoA缩合生成乙酰辅酶a;0.5 mol乙酰辅酶a转化为乙酸，得到0.5 mol乙酸。另外的0.5 mol乙酰辅酶a必须通过PFOR还原为0.5 mol丙酮酸，所需的还原铁氧还蛋白和二氧化碳由CODH氧化CO产生。要产生0.5 mol乳酸，需要1 mol NADH，它是由Rnf复合物产生的。综上所述，根据式2,1 mol甜菜碱和2 mol CO可制得0.5 mol醋酸盐和0.5 mol乳酸盐:

紫杉ΔhydBA/hdcr突变体甜菜碱+ CO产乳酸的生物化学和生物能量学研究Fd,;PFOR，丙酮酸;铁氧还蛋白氧化还原酶;LDH/ETF，电子分叉乳酸脱氢酶，GB，甘氨酸甜菜碱;DMG dimethylglycine;四氢呋喃,tetrahydrofolate;CODH/ACS, CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶;CoFeSP，类铁硫蛋白;MTI，甲基转移酶I;MTII，甲基转移酶II;CoP，类冠状蛋白。ATP合成酶的化学计量为3.3 Na+/ATP (Matthies et al. 2014)， Rnf复合物的化学计量为2 Na+/2 e -

（2）

在甘氨酸甜菜碱+ CO上生长时，∆hydBA/hdcr突变体只产生乙酸，与∆pyrE和∆hdcr突变体相似;这种发酵的ATP增益为每摩尔产物或产物的碳0.5 mol。另一方面，在异乳酸发酵过程中，ATP的增益降低到每碳0.37 mol。因此，在生长过程中，丙酮生成似乎比异乳酸发酵更有利，但在不需要最大ATP增益的静息细胞中，乳酸发酵显然更有利，原因不明。此外，在生长过程中产生的丙酮酸可能不会积累，而是用来建立生物量。

综上所述，本研究表明，定向基因工程可使糖发酵生成乳酸，也可使C1化合物生成乳酸，这为工业应用提供了新的前景。

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