摘要
本研究探讨了葫芦巴籽提取物石油醚部分对高脂饲料喂养去卵巢大鼠的治疗作用。将大鼠随机分为假性卵巢切除术(S.OVX)、卵巢切除术+高脂饮食(OVX + HFD)和治疗组。采集血样，评估血脂、血糖、肝脏标志物和炎症标志物。分离肝、肾、颈总动脉进行组织病理学观察。肝脏样品检测抗氧化、氧化应激标志物、脂联素mRNA表达和PPAR-γ。PE-TFG处理显著降低总胆固醇(18%)、低密度脂蛋白(20%)、肝脏标志物(28%)、瘦素(17%)、TNF-α(21%)，增加脂联素和PPAR-γ mRNA表达。大、微观肝脂肪变性，肝脏炎症，肾小管恶化，颈总动脉内膜和中膜厚度增加。这些病理改变被PE-TFG逆转。这种影响可能与植物雌激素和PE-TFG中的其他成分(如薯蓣皂苷元、酚类和类黄酮)有关。
介绍
植物雌激素是植物衍生的天然化合物，在体内表现出类似雌激素的作用，被用作激素替代疗法的天然替代品，以改善更年期症状。它们在结构上与体内内源性分泌的雌激素相同，因此，由于它们与体内雌激素受体的亲和力，它们充当雌激素(Surguchov等人，2021;Ionescu et al. 2021)。葫芦巴种子中的植物雌激素和其他多酚类物质;TFG)调节与血脂异常和更年期相关的炎症(Visuvanathan et al. 2022)。TFG种子粉通过延缓葡萄糖和脂肪酸的吸收来减少甘油三酯的合成，而葡萄糖和脂肪酸是三酰甘油的底物(Geberemeskel等人，2019)。TFG的降胆固醇作用也是由于胆汁酸的粪便排泄增加和肝脏中胆固醇的消耗(Bruce-Keller et al. 2020)。TFG还含有皂苷、生物碱和类黄酮，作为抗炎活性的主要化学成分。TFG种子提取物降低糖尿病大鼠的细胞因子IL-6和TNF-α (Joshi et al. 2015)。急性和亚急性毒性研究表明，TFG种子提取物可显著降低小鼠抗亚砷酸钠毒性的AST、ALT、ALP、LDH和GGT水平(Biswas et al. 2019)。TFG的管理也被认可为其雌激素成分，如葫芦巴碱、薯蓣皂苷元和类黄酮(皂苷)(Younesy等人，2014)。
大鼠是研究雌激素缺乏及其代谢影响的标准动物模型。大鼠卵巢切除术模拟人类更年期(Yousefzadeh et al. 2020)。雌激素缺乏通常与食物消耗增加和体重增加有关。肥胖是更年期妇女的另一个问题，可能会影响身体重要器官的氧化应激，包括肝脏(Brady 2015)。给大鼠喂食高脂肪饮食(HFD)是研究人类饮食中脂肪影响的有益模型。HFD是多种疾病的重要危险因素，包括代谢和心血管疾病(CVD)。HFD长期导致非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。TNF-α等炎症信号促进瘦素和瘦素受体的表达(La Cava 2017)。脂联素是一种胰岛素增敏激素，具有抗炎和抗动脉粥样硬化的特性。脂联素水平在肥胖啮齿动物和人类中降低。PPAR-γ的表达增加可以防止与肥胖相关的胰岛素抵抗。从我们之前的研究中，我们观察到卵巢切除术和hfd诱导的肥胖可能是脂联素和PPAR-γ表达降低的重要原因之一(Nagamma et al. 2019b, 2021, 2022)。在之前的研究中，我们发现PE-TFG种子提取物在卵巢切除术模型中具有抗炎活性(Nagamma et al. 2022)。本研究旨在探讨三角Trigonella foenum-graecum L.种子提取物石油醚部分(PE-TFG)对去卵巢大鼠HFD喂养的治疗作用。
材料与方法
材料
TFG种子(Pro Natural, 100%有机种子)PE-TFG按照之前的报道(Nagamma et al. 2019a)制备，随后在0.5%羧甲基纤维素(CMC)中配制，并以50 mg/kg/天的剂量口服。薯蓣皂苷元(Sigma-Aldrich, 98%纯度)以0.5% CMC配制，50mg /kg/天口服。阿托伐他汀配制成0.5% CMC，口服10mg /kg/天。17β-雌二醇(E8515-5 G, Sigma-Aldrich)配制于芝麻油中，皮下注射100 μg/kg/d。
高脂肪膳食成分(1公斤):颗粒粉325克，猪油400克，酪蛋白100克，蔗糖100克，胆固醇50克，维生素20毫升，双酒石酸胆碱5克(Buettner et al. 2007)。
方法
Sprague Dawley大鼠的获取
动物实验是按照国家和国际准则进行的，并在调查前获得了机构动物伦理委员会的批准。本研究选用体重150 ~ 200 g、年龄2 ~ 3月龄的健康雌性Sprague Dawley大鼠。老鼠被关在中央动物饲养设施，并得到悉心照顾。切除卵巢大鼠和假卵巢大鼠分别饲喂标准颗粒饲料和随意饮水，然后随机分为治疗组。
卵巢切除术诱导绝经及治疗方案
36只大鼠随机分为两组:假性卵巢切除术(Sham ovariectomy, S.OVX)组和OVX组。通过腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg体重)和噻嗪(5 mg/kg体重)诱导OVX大鼠镇静。在评估撤退和眨眼反射后，大鼠准备进行下腹部手术，并进行双侧卵巢切除术(Anjaneyulu et al. 2018)。上述手术技术在不切除卵巢的假手术大鼠中进行。将大鼠分为假性卵巢切除术(S.OVX)、卵巢切除术+高脂饮食(OVX + HFD)两组。切除卵巢3周后，所有大鼠均饲喂HFD 12周。HFD治疗12周后，再将大鼠分为4组，分别给予PE-TFG种子提取物(OVX + HFD + PE-TFG)、ATR (OVX + HFD + ATR)、DIS (OVX + HFD + DIS)、E2 (OVX + HFD + E2)治疗12周。研究计划以图形形式示于图1
研究设计。每组6只(n = 6)。S.OVX假卵巢切除术，OVX卵巢切除术，HFD高脂肪饮食，PE-TFG油醚提取物，ATR阿托伐他汀，DIS薯薯苷元，E2 17β-雌二醇，MDA丙二醛，GSH谷胱甘肽
每周记录体重，计算各组大鼠体重指数(BMI)，计算公式为:体重(g)/体长cm2。补充12周后，每只大鼠穿刺眶后神经丛取空腹血样(2ml血)，并收集血清。处死大鼠后，立即分离肝、肾、颈总动脉(CCA)进行进一步研究。测定肝组织中脂联素、PPAR-γ、抗氧化和氧化应激指标mRNA表达量。将一小部分肾脏、肝脏和CCA固定在10%福尔马林中进行组织学分析。
目录
摘要 介绍 材料与方法 生化参数 结果 生化试验结果 讨论 结论 数据可用性 参考文献 致谢 作者信息 道德声明 补充信息 搜索 导航 #####生化参数
估计血脂剖面
血清TC、HDL和甘油三酯(TG)用阿斯彭有限公司的标准试剂盒进行酶法测定。印度新德里。采用Friedewald公式评估血清LDL (Friedewald et al. 1972)。动脉粥样硬化指数(AI)和冠状动脉风险指数(CRI)分别以log (TG/HDL)和TC/HDL计算(Abedinzade et al. 2015)。
葡萄糖的测定
采集血液样本后，立即将一小滴滴在Accu-check血糖仪的试纸上，并记录读数。结果以mg/dl表示。
肝酶
谷草转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平采用印度新德里Aspen有限公司提供的标准试剂盒进行评估。将样品(100µl)与1 ml工作液混合，在37℃下孵育1分钟。采用半自动分析仪测定酶活性，根据试剂盒说明将吸光度(OD)固定在340 nm。结果用U/l表示。
硫代巴比妥酸反应物质的估计
取匀质组织溶液100 μl，加入0.67%硫代巴比妥酸1000 μl和20%三氯乙酸500 μl。然后将试管在100ºC水浴中孵育20分钟。随后，冷却试管，将上清液转移到埃彭多夫小瓶中。然后将小瓶以12,000 rpm离心5分钟。在532 nm处读取上清吸光度(1995)。结果以nmol/mg湿组织表示(Nagamma et al. 2019b)。
还原型谷胱甘肽的估计
取100µl肝脏匀浆加入100µl 5%三氯乙酸(TCA)溶液中，5000rpm离心5min。微孔板96孔，取上清25µl加入150µl磷酸钠缓冲液(PBS 0.2 M, pH 8.0)和25µl 0.6 mM 5,5 -二硫代-二-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。然后在室温下孵育10分钟，使用酶联免疫吸附仪(Nagamma et al. 2019b)在412 nm处读取吸光度。
血清瘦素测定
采用RayBio leptin ELISA试剂盒检测血清瘦素水平。ELISA试剂盒是一种基于三明治原理的固相酶免疫分析法，用于血清中瘦素的体外定量诊断测定。颜色强度与瘦素浓度成正比。以pg /ml表示。
肿瘤坏死因子- α (TNF-)测定
血清TNF-水平按照ELISA试剂盒(目录号:ELR-TNFa-CL, RayBio®)中提到的方案，采用ELISA法定量测定。将样品的OD值与标准曲线进行比较，计算出样品的浓度。以pg/ml表示。
前女友脂肪压缩连接素和PPAR-γ
使用Purelink RNA分离试剂盒(Invitrogen, USA)从冷冻肝组织中获得RNA，使用Superscipt III第一链合成试剂盒(Invitrogen, USA)按照制造商说明制备cDNA。针对GAPDH、PPAR-γ和脂联素的所有引物均扩增出cDNA模板。PCR在25µl反应混合物中进行，反应混合物中含有1X PCR缓冲液(Thermo scientific，美国)，1µg正向和反向引物(Bioserve，印度)，0.25 mM dNTP混合物(Applied Biosystems，美国)和2单位DNA聚合酶(Thermo scientific，美国)，在PeqSTAR Thermal cycler (PeqLab，德国)中进行。PCR产物在琼脂糖凝胶(2%)中观察，用溴化乙啶染色，在紫外透照器上拍摄。引物序列为:GAPDH Forward -CTAGAGACAGCCGCATC;GAPDH反向- GGGTAGAGTCATACTGGAAC;脂联素正向- aatcctgcccagtcatgaag;脂联素反向- catctcctgggccaccctta; PPAR-γ正向- CATGACCAGGGAGTTCCTCAA。PPAR-γ逆转- GCAAACTCAAACTTAGGCTCCATAA。使用ImageJ软件获得波段的强度，并表示为图形(Nagamma et al. 2022)。
组织病理学分析
对经福尔马林固定的肝脏、肾脏和颈总动脉组织进行处理，并用苏木精和伊红(H&E)染色。用两次变换二甲苯进行脱石蜡，每次5min。然后，将载玻片用不同等级的酒精(100%、90%、70%和50%)用蒸馏水水化2分钟和5分钟。染色方法:切片用苏木精染色5分钟，然后在自来水下保存10分钟进行染色。发蓝后，用1%含水伊红染色1分钟。用90%和100%酒精脱水，用二甲苯清除，然后用DPX贴装(Xu et al. 2013)。由马尼帕尔Kasturba医学院解剖学系的解剖学专家用光学显微镜比较各组之间的组织学变化。然后将这些报告汇编起来进行比较。
统计分析
Graph Pad Prism Version 5.0采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析对数据进行评价。结果以均数±SEM表示。P≤0.05认为差异有统计学意义。
结果
PE-TFG对体重和BMI的影响
每隔一周监测大鼠体重24周，结果见图2A。各组均饲喂HFD 12周。0周时各组平均体重无显著差异。第24周末，OVX + HFD组与S.OVX组相比，体重显著增加(P < 0.001)。PE-TFG、ATR和E2处理组大鼠体重显著降低(P < 0.01)。
OVX组饲喂HFD的体重和BMI。A平均体重;B BMI。数值以平均值±SEM表示。s.v OVX vs. OVX + HFD: aP < 0.001;OVX + HFD组与OVX + HFD组bP < 0.05(单因素方差分析，Bonferroni检验)。S.OVX假卵巢切除术，OVX卵巢切除术，HFD高脂肪饮食，PE-TFG油醚提取物，ATR阿托伐他汀，DIS薯蓣皂苷元，E2 - 17β-雌二醇
实验开始时，组间BMI无明显差异(图2B)。然而，与S.OVX相比，OVX + HFD组24周后BMI显著增加(P < 0.001)。与OVX + HFD组相比，PE-TFG、ATR、DIS和E2治疗显著降低了BMI水平(P = 0.02)。
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