摘要

目的

维生素D对运动引起的免疫功能障碍的影响尚不清楚。本研究的目的是调查维生素D状态(循环25(OH)D)对长时间运动的先天免疫反应和代谢组学特征的影响。

方法

23名健康、有娱乐活动的男性(25±7岁);最大摄氧量[结果

血浆25(OH)D缺乏的参与者平均淋巴细胞总数较低(平均差值[95%置信区间]，0.5个细胞× 109 L [0.1, 0.9])， p = 0.013)，中性粒细胞:淋巴细胞比率较高(1.3个细胞× 109 L， [0.1, 2.5]， p = 0.033)。与非缺乏组(1% [- 20,21]，p = 1.000)相比，缺乏组从运动前到运动后1小时血液中性粒细胞中细菌刺激弹性酶(- 43% [- 70，- 15]，p = 0.003)减少。血浆代谢组学分析显示，根据维生素D状态，参与者之间存在明显的分离。组间差异的主要来源是嘌呤/嘧啶分解代谢物、炎症标志物(亚油酸途径)、乳酸和酪氨酸/肾上腺素。

结论

这些发现为维生素D状态对运动引起的先天免疫防御参数和代谢组学特征(如炎症和代谢应激标志物)变化的影响提供了证据。

介绍

在单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞中发现维生素D受体(VDR)和维生素D代谢酶，使人们认识到维生素D在调节免疫反应中的重要作用[1]。在先天免疫中，维生素D在微生物识别和抗菌反应激活之间的相互作用中是必不可少的[2]。VDR基因与编码抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)的基因非常接近[3]，其活性形式为维生素D(1,25二羟基胆钙化醇)，可上调抗菌肽如cathelicidin和β-防御素的表达[4,5]。维生素D代谢物可直接增强单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的关键效应功能(趋化、吞噬和活性氧的产生)[6,7,8]。

人们普遍认为，在长时间剧烈运动后，细胞和粘膜免疫会发生短暂的扰动(通常称为免疫抑制的“开放窗口”)[9]。如果这种运动与其他生活压力因素(如营养不足、心理压力)一起进行，则可能增加上呼吸道疾病(URI)的易感性[10]。维生素D状况是导致个体更容易发生URI的一个因素[11]。与较高的循环维生素D浓度相比，低维生素D状态与耐力运动员(67%对27%)或接受训练的军事人员(9%对6%)的URI发生率更高有关[2,12]。据报道，高纬度地区、冬季和早春季节和/或阳光照射最少(例如参与室内体育活动，[13])的运动员体内维生素D水平较低。尽管认识到维生素D状态的变化可能对免疫有直接影响[14]，但循环维生素D浓度对急性运动引起的免疫功能障碍的影响尚不清楚。

25(OH)D的循环浓度被认为是维生素D状态的主要指标。然而，对于何种浓度的25(OH)D构成维生素D缺乏、不足、充足和毒性一直存在争议[15]。鉴于维生素D与许多生物效应有关，我们有理由认为，最佳水平可能取决于特定的生理功能或健康结果。目前对于免疫系统25(OH)D的最佳阈值尚无共识[16]。在有限的运动员群体免疫学研究中，有报道称，较低的维生素D浓度(< 33 nmol/L)与先天吞噬细胞(单核细胞)在应对运动员多抗原挑战时产生的促炎细胞因子较低有关，也与较低的血浆抗菌肽浓度有关[2]。在一项军事人员的研究中，与初次接种时25(OH)D在41 - 71 nmol/L(平均56±9 nmol/L)之间的参与者相比，循环25(OH)D≤40 nmol/L(平均30±7 nmol/L)的参与者对乙型肝炎疫苗的免疫应答较差。在这些人群中进行的一些[17]但不是所有的干预研究[12]表明，先天免疫的标志物(血浆抗菌肽、唾液流率)可以随着口服维生素D的补充而改变(每日胶囊剂量400-5000 IU，持续12 - 14周)。

尽管维生素D状态(~ < 33 nmol/L)是静止先天免疫的标志物，但需要采用系统生物学方法进行进一步的人体机制研究，以阐明维生素D状态是否具有生理作用，还是仅仅与这些事件相关[18,19](即免疫抑制的标志物)。剧烈运动对人体代谢有着深远的影响，尽管大多数研究都集中在一个狭窄的代谢物范围内[20]。代谢组学提供了一种创新的方法，在分子水平上对个体进行表型分析，提供了同时准确测量数百种代谢物的可能性[21]。它允许在运动或营养干预期间对许多代谢途径和体内复杂的相互作用进行公正的知识扩展[22,23]。尽管维生素D状态已被证明会影响代谢特征[24,25]，但迄今为止，缺乏已发表的研究来说明维生素D状态对长时间运动后代谢改变的影响。此外，在运动免疫学研究中，仍然缺乏使用高通量实验室方法(如代谢组学和免疫标记)的调查，以更好地了解运动和/或营养调节作用背后的机制。

我们研究的主要目的是调查维生素D状态对长时间运动的先天免疫反应的影响。其次，我们采用了代谢组学分析方法，以表明免疫系统如何与血浆25(OH)D浓度相关。

材料与方法

设计

这是对营养干预(急性和4周牛初乳补充)和长时间运动免疫反应的两项随机对照试验的二次分析[26]。这项研究的参与者参加了这些试验的对照组(安慰剂组)。

参与者

23名健康、有娱乐活动的男性(25±7岁);96%为白人;体重[BM] 76±8 kg;高度179±6cm;最大摄氧量[max] 56±9 mL·kg−1·min−1)自愿参加。这项研究是按照《赫尔辛基宣言》的原则进行的。阿伯里斯特威斯大学研究伦理委员会在招募任何参与者之前批准了所有实验程序。参与者提供了口头和书面同意以下信息的实验程序。所有参与者都不吸烟，在研究开始前和研究期间的4周内没有感染症状，也没有服用任何药物或膳食补充剂。

初步的测试

在主要实验访问前14天，通过在电动制动自行车计力计(荷兰格罗宁根的王剑Lode Excalibur)上进行连续增量测试(在3分钟的无负载基线蹬车后30 W∙min - 1斜坡速率)至自愿衰竭来确定气体交换阈值(GET)和最大值。在增量测试期间，使用在线呼气气体分析系统(Jaeger Oxycon Pro, Hoechberg，德国)分析过期气体。如前所述，当参与者的节奏比他们喜欢的节奏低10转/分超过10秒时，测试终止[27]。对于每个参与者，max由测试期间最高的30秒平均值决定。通过v斜率法估计每个参与者的GET[28]。运动强度被设定为输出功率的15% Δ(达到极限时输出功率与达到极限时输出功率之差的15%)，相当于这些参与者的最大功率的约55-60%。使用% Δ可以更准确地控制相对强度，更好地规范受试者间生理需求和反应[27]。在主要实验访问前7天，进行了一个熟悉试验，以使参与者适应主要实验试验中预期的测试程序和身体压力。参与者在电子制动自行车计力器(如上所述)上进行了2.5小时的锻炼，强度为15% Δ。在运动的第10、30、60、90和120分钟进行呼气分析，验证所选择的负荷确实达到了目标强度。在治疗过程中，心率(HR)和RPE每15分钟监测一次，分别使用遥测设备(Polar S610, Polar Electro Oy, Kempele, Finland)和Borg量表[29]。

实验试验程序

在实验前的48小时内，参与者被要求避免剧烈运动和饮酒。在实验试验的早晨，参与者在禁食至少10小时后，于09:00到实验室报到。参与者被要求在到达前2小时喝500毫升水，以促进补水。参与者保持坐姿10分钟，然后从肘前静脉采集静息血液样本和未受刺激的唾液样本(见下面采样的细节)。收集样本后，参与者立即开始以15%的速度骑行2.5小时Δ。所有参与者在运动期间每15分钟被允许喝稀释的甜酒(4体积水兑1体积无糖甜酒，浓度为2 mL·kg BM)，但在运动结束时不允许(以限制唾液样本的污染)。在运动的第30、60、90和120分钟对过期气体进行分析(Jaeger Oxycon Pro, Hoechberg, Germany)。在治疗过程中每15分钟监测一次HR和RPE。参与者在运动后立即和1小时禁食进一步的血液和唾液样本。

血液采样

除了在运动结束后几分钟内立即抽取的运动后样本外，参与者保持坐姿，在每次血液样本采集前进行10分钟的最小运动。分别于运动前、运动后及运动后1 h采集血液。通过静脉穿刺(用21号PrecisionGlide针[Becton-Dickinson, Oxford, UK])从肘前静脉采集血样，并将其注入含有三钾乙二胺四乙酸(K3EDTA)或肝素锂的真空容器(Becton-Dickinson, Oxford, UK)。使用自动血液学分析仪(Pentra 60 C +血液学分析仪，HORIBA Medical，蒙彼利埃，法国)测量每个K3EDTA真空容器中的血红蛋白、总白细胞和差异白细胞计数。用标准微离心法(Hawksley微离心机)从全血(抗凝肝素)中测定红细胞压积。这与先前获得的血红蛋白浓度一起使用，以估计先前描述的从运动前到运动后血液和血浆体积的变化[30]。剩余的肝素和K3EDTA真空容器中的血液在1500 g下在4°C下离心10分钟，随后的血浆在- 80°C下储存，用于后期分析维生素D状态(25(OH)D)，弹性蛋白酶和代谢组学分析。

体外血中性粒细胞功能

根据先前的研究[27,31]，在使用市售化学发光(CL)试剂盒(ABEL, Knight Scientific Ltd, Plymouth, UK)测量体外刺激的中性粒细胞对PMA的氧化爆发反应之前，在运动前、运动后和运动后1小时，将K3EDTA处理过的管中的全血置于微离心管中，并在室温下储存(不超过2小时)。利用微孔板光度计(FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech, Aylesbury, UK)测量每孔的CL。

在所有pma刺激的样品中，以相对光单位(RLU)记录CL，每隔20秒记录30分钟，并计算CL曲线下的面积。每个样品的未刺激CL曲线下的面积从重复刺激样品的平均面积中减去，以确定pma刺激CL。为了在每个细胞的基础上解释氧化爆发反应，假设CL反应主要归因于样品中的中性粒细胞[32]。因此，在CL曲线下的pma刺激面积除以每孔中存在的中性粒细胞的数量，得到每个中性粒细胞的RLU(即氧化爆发反应)CL。

根据先前的研究评估中性粒细胞脱颗粒反应[27,33]。中性粒细胞脱颗粒的测定方法是将1 mL肝素化后的血液样本加入含有50 μL含有金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌和产肠杆菌提取物的兴奋剂的微离心管中(840-15,Sigma, Poole, UK)。在37°C孵育1小时前，先将试管轻轻倒置混合。所有试管在孵育期间中途轻轻混合。孵育后，16000 g离心2分钟，立即除去上清，保存在- 80°C，以待进一步分析。室温解冻后，中性粒细胞脱粒反应基于使用ELISA试剂盒(Merck calibichem, Darmstadt, Germany)测量每个中性粒细胞受刺激的弹性酶释放量。细菌刺激的弹性酶释放量计算为受刺激和未受刺激样品的弹性酶浓度之差。未受刺激的样品立即处理，以提供特定时间点的背景血浆弹性酶浓度(即不与受刺激的样品一起孵育)。

为了便于受试者间比较，根据以往的研究[27,34]，运动后和运动后1小时中性粒细胞反应以运动前值的百分比表示。

等离子体25 (OH) D

EDTA血浆样品解冻至室温，在独立实验室(英国梅瑟蒂德菲尔查尔斯王子医院临床生物化学系)分析总25(OH)D (25(OH)D3和25(OH)D2)之前进行脱蛋白处理。样品沉淀后，25(OH)D (25(OH)D3和25(OH)D2采用Chromsystems 25 OH维生素D液相色谱串联质谱仪试剂盒和液相色谱串联质谱仪(Agilent 6410)进行多反应监测。试验内变异系数< 10%。

等离子体我tabolomics

按照Jones等人[21]描述的程序提取代谢物。在LTQ线性离子阱(热电子公司)上对玻璃小瓶进行了盖帽和随机顺序分析。在4个扫描范围内(15-110、100-220、210-510和500-1200 m/z)交替的正、负电离模式下获取数据，采集时间为5分钟。通过对KEGG(京都基因与基因组百科全书)(http://www.kegg.jp/)和人类代谢组(http://www.hmdb.ca/)数据库进行统计分析和查询，选择并初步鉴定出具有歧视性的代谢物。为了证实这些鉴定，使用TriVersa NanoMate(咨询生物科学有限公司)在LTQ-FT-ULTRA (Thermo Scientific)上使用靶向纳米流傅里叶变换-离子回旋共振超质谱法(FT-ICR-MS)进一步研究了名义质量信号，以获得超高精度的质量信息和MSn离子树。FT-ICR-MS的准确度为1ppm，在此范围内排名最高的代谢物被指定为每个歧视性负电离模式代谢物的鉴定。

亚油酸和花生四烯酸在质谱中的浓度根据质谱总离子分数的百分比推导标准曲线(0.001、0.01、0.1和1 mg/mL)计算。

唾液取样

除了在运动结束后几分钟内立即进行的唾液样本外，参与者保持坐姿，在每次唾液样本之前进行10分钟的最小运动。在运动前、运动后和运动后1 h采集血液样本后采集唾液样本。所有唾液样本在采集前至少10分钟用清水冲洗口腔。参与者被要求在每次唾液取样之前吞咽以便清空口腔。为了获得样品，参与者保持坐姿，头部微微前倾，被动地滴入预先称重的7ml无菌bijou管中，同时保持面部运动到最小。记录最后的收集时间，并重新称重，以便在假设唾液密度为1.0 g·ml - 1的情况下计算唾液流速[33]。

唾液采集后，16000 g离心5分钟，留下颗粒碎片，留下剩余的透明上清，在- 80°C保存，供以后分析。所有唾液样本在分析前仅在室温下解冻一次。唾液解冻后，样品再次在16000 g下离心5分钟，沉淀粘蛋白和其他碎屑，并允许分析得到的清晰上清。使用凝固点降低渗透计(Osmomat 030, Gonotec, GmbH, Berlin, Germany)，测定唾液渗透压，以便相对于唾液渗透压表达唾液免疫参数的浓度。

使用ELISA试剂盒(唾液血液污染酶免疫测定试剂盒，Salimetrics, State College, Pennsylvania, USA)测定唾液转铁蛋白浓度，筛选等量唾液的血液污染。如果唾液中转铁蛋白浓度大于1mg dL−1，则认为该样本被血液污染，该参与者的所有其他唾液数据均被排除。

唾液抗菌肽

抗菌肽浓度的测定参照Jones等[21]的方法。将唾液上清液(PBS)稀释1000倍和8000倍后，使用市售ELISA试剂盒分别测定唾液乳铁蛋白(sLac)和溶菌酶(sLys)的浓度(Assaypro LLC, St-Louis, MO)。

统计分析

本研究未进行正式的样本量计算。样本量由先前两项随机对照试验的对照组中可用的参与者数据确定。除非另有说明，文本、表格和图表中的数据均以平均值±标准差表示。所有数据均通过统计计算机软件包SPSS (v25.00;SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。首先，对免疫指标进行双因素混合方差分析(组×时间)，以确定按维生素D状况分类的组之间时间的影响是否不同。根据耐力运动员血浆25(OH)D和先天免疫反应(血浆cathelicidin，单核细胞源性细胞因子产生)的数据[2]，参与者被分为血浆总25(OH)D缺乏(< 33 nmol/L)和非缺乏(> 33 nmol/L)两组。在方差分析中发现的组或组×时间相互作用的任何显著主效应，均通过Holm-Bonferoni校正的事后t检验(特定时间点组间)和每组内的单向重复测量方差分析进一步分析(必要时，还进行Holm-Bonferoni校正的事后t检验，组内时间间)。运动后中性粒细胞反应与血浆25(OH)D浓度的相关性也采用Spearman等级相关系数。在主试验期间，采用独立t检验确定各组间HR、摄氧量或RPE的显著差异。p < 0.05为有统计学意义。在去除低于50 m/z的代谢物后，用每个样品的总离子计数将fe - ms数据归一化，用于将每种代谢物的强度值转换为总离子计数的百分比。代谢组学数据集的多变量分析(主成分分析[PCA]和方差分析，层次聚类分析(HCA))使用基于r的metaboAnalyst 2.0界面完成[35]。

目录

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结果

英航丝氨酸特征，生理反应和RPE

研究参与者的基线特征见表1。在主试验期间，两组间的绝对比值(p = 0.224)和相对比值(p = 0.549)均无显著差异(缺陷:2185±252 mL·min - 1, 55±2% max;非缺陷:2458±544 mL·min−1;56±6% max)。血浆25(OH)D缺乏(134±18 bpm)组与非缺乏(134±11 bpm)组的HR反应无差异(p = 0.994)。两组RPE差异无统计学意义(p = 0.311)(缺乏组:12.5±0.7;>非缺乏组:13.0±1.2)。运动对血糖浓度没有影响，两组间血糖浓度也没有差异(双因素方差分析，组，p = 0.640;时间，p = 0.385;组×时间交互作用，p = 0·612)。在两组试验中，运动前的血浆容量变化模式相似:缺乏;运动后(−2.5±4.2%);运动后1 h(0.79±4.9%)，无缺陷;运动后(−4.4±2.7%),1小时运动后(−1.3±4.8%)。由于试验间无显著差异(组间互作;P = 0.549)，认为没有必要纠正血浆容量变化的任何血液学参数。

循环总细胞计数和分化细胞计数

分析显示，两组对总淋巴细胞计数(p = 0.013)和中性粒细胞/淋巴细胞比值(p = 0.033)有显著的主效应。与不缺乏维生素D的人相比，缺乏维生素D的人淋巴细胞总数较低，中性粒细胞:淋巴细胞比率较高。各组对循环总白细胞、中性粒细胞和单核细胞均无时间×组交互作用或主作用(表2)。各组白细胞计数均有时间的主作用(p < 0.001)(表2)。运动前与运动后总白细胞、中性粒细胞、单核细胞、中性粒细胞/淋巴细胞比值(p≤0.01)和运动后1 h(淋巴细胞除外)均显著升高(p < 0.01)。运动后1 h，中性粒细胞与淋巴细胞之比显著升高(p < 0.001)，淋巴细胞总数显著降低(p < 0.001)，单核细胞总数显著降低(p = 0.017)。

中性粒细胞反应

双向混合方差分析显示，组对每中性粒细胞刺激弹性蛋白酶释放(中性粒细胞脱颗粒)有显著的主效应(p = 0.010)，缺乏组的反应较低。组×时间相互作用(p = 0.003)也观察到每个中性粒细胞受刺激的弹性蛋白酶释放(中性粒细胞脱粒)(图1A)。单因素方差分析显示，时间对缺陷组有显著的主要影响(p = 0.006)，而对非缺陷组无显著影响(p = 0.383)。进一步的事后分析显示，缺乏组从运动前到运动后1小时显著下降(p = 0.007)。各组间各时间点的双尾独立t检验也显示，缺乏组在运动后1小时细菌刺激弹性酶浓度显著降低(p = 0.003)。此外，在所有参与者中，从运动前到运动后1小时，血浆25(OH)D与细菌刺激弹性酶浓度变化呈正相关(r = 0.458, P = 0.028)。

细菌刺激弹性蛋白酶释放(A)和PMA刺激化学发光(B)在长时间运动后根据维生素D状态。*与运动前比较差异有统计学意义(p < 0.05);†与运动后1 h相比差异有统计学意义(p < 0.05)

对于pma刺激的每中性粒细胞CL(中性粒细胞氧化破裂)，观察到时间的显著主要影响(p < 0.001)(图1B)。与运动前相比，运动后和运动后1小时pma刺激的每中性粒细胞CL显著降低(p = 0.001)。对于pma刺激的每中性粒细胞CL，实验组(p = 0.857)和×time组(p = 0.258)没有主要影响(图1B)。

等离子体我tabolomics

代谢组学方法用于确定维生素D状态对长时间运动代谢反应的影响。使用质谱法筛选三个时间点的血浆代谢物谱，随后使用多变量方法进行分析。PCA的应用显示了两个样本组(维生素D状态组)之间的分离以及对运动的反应的一些差异(图2)。因此，在血浆(25OH)D浓度不足的参与者中，观察到运动后和运动后1小时样本之间的分离。

血浆代谢组根据运动和维生素D状态的分化。对运动前(PRE)、运动后立即(PO)和运动后1小时(1H)受试者血浆代谢物谱进行主成分分析。分析还细分为血浆维生素D浓度不足(< 33 nmol/L)和非缺乏(> 33 nmol/L)的参与者。彩色圆圈表示每个实验班的95%置信区间。红线和维生素D < 33或> 33 nmol/L组的适应症是为了说明目的，没有数学意义

双因素混合方差分析(组×时间)，校正了错误发现率，确定了计算的m/z是变异的主要来源。对KEGG和人类代谢组数据库的查询允许对相应代谢物进行推定鉴定(表3)。样品采用高分辨率质谱法进行评估，m/z精度为1 ppm，以进一步确认代谢物的身份。每个样本组的平均值使用热图和树形图(图3A)显示，表明非缺乏组的代谢物在运动期间没有太大变化。这些代谢物的水平在运动前缺乏的样本中没有差异。然而，运动后，特别是运动后1小时，只有缺乏组的所有代谢物都显著升高。当使用方框图和晶须图绘制结果时，也显示了缺乏组运动后的这些增加(图3B)。

不同维生素D水平的参与者运动前后血浆主要代谢物的变化。方差分析确定了代谢物是运动前(PRE)、运动后立即(PO)和运动后1小时(1H)参与者代谢组变化的主要来源。分析还细分为血浆维生素D浓度不足(< 33 nmol/L)和非缺乏(> 33 nmol/L)的参与者。(A)使用热图和分层聚类分析表示每种代谢物和类别的平均值。(B)用方框图和须状图表示了代谢产物缺陷(< 33 nmol/L)和非缺陷(> 33 nmol/L)分类的差异

考虑到代谢物的生化功能(表3)，乳酸的增加表明缺氧组的无氧呼吸增加。体力消耗伴随着肌肉中核苷酸降解的增加，嘌呤/吡啶降解产物随着维生素d的减少而增加。酪氨酸/肾上腺素的增加与缺乏维生素d组在运动期间压力的增加一致。

在多变量分析中，亚油酸(LA)被证明是变异的主要来源之一。LA是花生四烯酸(AA)的前体。AA在这种炎症或其他免疫反应中形成了具有多种生理和病理作用的类二十烷类功能。因此，我们计算了样品中LA和AA的确切浓度(图4)。这些数据证实，维生素D缺乏组在运动后1小时LA增加(图4A)，但AA似乎在所有运动阶段都升高。Pearson相关分析显示，亚油酸(LA)与花生四烯酸(AA)呈极显著正相关(相关系数为0.821;p = 0.000)。此外，变量之间的线性回归返回显著相关(R2 = 0.673, p < 0.001)。

运动前后血浆中亚麻酸和花生四烯酸的浓度与维生素D水平的关系。通过与LA和AA标准品的标准曲线比较，采用针对性分析方法准确测定了亚麻酸(LA)和花生四烯酸(AA)的浓度。分类分为运动前(PRE)、运动后立即(PO)和运动后1小时(1HR)。血浆维生素D浓度不足(< 33 nmol/L)或不缺乏的参与者分别用灰线和黑线表示

粘膜反应

各组、时间及组间交互作用对唾液流率无显著主效应。在8名参与者的唾液样本中检测到血液污染，在sLac和sLys反应中，缺陷组和非缺陷组分别留下n = 5和n = 10。因此，效应量也被报道来支持解释(补充信息表S1)。当以绝对浓度、分泌速率或相对唾液渗透压表示时，组间或组间x时间相互作用对唾液抗菌肽没有显著的主要影响(补充信息表S1)。时间对sLac的主要影响是渗透压(p = 0.014)，而不是sLac浓度(p = 0.103)或分泌率(p = 0.416)(补充信息表S1)。事后分析发现，与运动前相比，运动后的sLac渗透压较低(p = 0.012)。时间对sLys浓度(p = 0.649)、sLys分泌率(p = 0.546)和sLys渗透压(p = 0.208)均无主要影响(支持信息表S1)。

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