摘要

姜黄素(CRN)是一种低生物利用度的强效抗癌药物，用于治疗前列腺癌。采用高压均质(HPH)法制备的NLCs粒径约为150 nm， ζ-电位为- 40 V，具有优异的长期稳定性。CRN-SLN的细胞摄取显示纳米颗粒定位在细胞核周围的细胞质中。采用流式细胞术评估CRN- nlcs，发现在100 μg/ml CRN浓度下可引起早期和晚期凋亡事件。将CRN- nlc纳米颗粒给予LNCaP前列腺癌异种移植裸鼠，与纯CRN(乙醇溶液)相比，显示出明显的肿瘤体积抑制(40%)，体重没有减轻。总的来说，NLCs被证明是被动药物传递和癌症治疗的合适载体。

图形抽象

介绍

纳米结构脂质载体(nlc)是一种多功能的药物递送系统，已被用于递送原料药，具有增强的临床疗效。它们的广泛适用性在于它们所具有的独特特性，如增加药物包封性、被包封药物的长期物理和化学稳定性、表面功能化和位点特异性靶向[1,2]。此外，它们可以在无菌条件下使用高压均质(HPH)轻松生产，而放大可以在批量或连续模式下进行，达到100-150 kg/h的容量。

NLCs由Rainer H. m ller(柏林/德国)和Maria Rosa Gasco(都灵/意大利)引入，由固体和液体脂质混合物组成，由于脂肪酸链之间的距离较大，导致脂质基质不完善[3]。许多研究已经证明了为什么与其他纳米脂质递送系统相比，NLCs被认为是一种优越的药物递送系统。Alam等人开发了装载isradipine的NLCs用于治疗高血压和心肌梗死[4]。临床研究表明，由于isradipine提高了生物利用度，NLC治疗显著阻止了心脏的抗氧化状态和超微结构的变化。利用热可逆NLCs形成原位植入物，实现戊酸雌二醇的持续释放[5]。与商业混悬液相比，开发的NLC配方的AUC增加了16.8倍，Cmax增加了40倍。

由于水不溶性原料药的溶解度提高，nclc也被用作透皮给药的载体[4,6,7,8,9,10]。一项皮肤动力学评估涉及给药具有超小粒径(< 100 nm)的负载luliconazole的NLCs的抗真菌活性[6]。将纳米颗粒装入局部凝胶中，临床结果显示，与市场上销售的乳膏相比，Cmax增加了两倍，AUC增加了三倍。最近，一种新的NLC制剂被设计用于联合递送他克莫司和siRNA治疗牛皮癣[11]。体内研究证实了NLCs的优势，显著降低了细胞因子TNF-α的表达，并证实了他克莫司与TNF-α siRNA的协同作用，其增效作用增加了7倍。在其他研究中，NLCs已被报道用于脑靶向治疗阿尔茨海默病[12]或用于淋巴靶向和抗hiv药物的递送[13]。

然而，ncl已被广泛用于联合化疗的癌症治疗，以克服与肿瘤相关的挑战[14,15]。在最近的一项研究中，通过结合叶酸给药多西紫杉醇和姜黄素，开发了表面工程的NLCs用于联合化疗。双重给药具有减少剂量、克服多药耐药等优点，并可产生协同效应。小鼠肺癌的体内研究显示，与taxotree®相比，多西他赛的生物利用度和肿瘤消退增强。装载伊鲁替尼的NLCs是使用质量设计方法开发的，用于治疗慢性淋巴细胞白血病。与游离Ibrutinib相比，106 nm的纳米颗粒和70%的包封效率显示出改善的药代动力学结果，Cmax(2.9倍)，AUC(5.3倍)和平均停留时间(1.8倍)增加。通过加入环己亚胺阻断乳糜微粒流动来研究NLCs的淋巴摄取，临床疗效也更好。

在目前的研究中，我们开发了姜黄素负载的NLCs用于治疗前列腺癌。纳米颗粒在储存过程中表现出良好的物理稳定性，并在细胞摄取和细胞毒性方面表现出剂量依赖性。体内动物研究表明，与散装姜黄素相比，有显著的肿瘤消退。

材料

三硬脂酸、油酸、硬脂酸、Tween 80和姜黄素购自Merck (Gillingham, UK)。Lutrol 407由英国巴斯夫公司提供。所有其他溶剂，如乙腈(ACN)、乙醇(EtOH)和化学品均为分析级。LNCaP细胞系来自美国弗吉尼亚州American Type Culture Collection (Virginia, USA)。噻唑蓝溴化四氮唑(MTT)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、青霉素链霉素、l -谷氨酰胺、热灭活胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶也从默克(英国)获得。Annexin V凋亡检测试剂盒I购自BD Biosciences。

方法

NLC纳米颗粒的制备

NLCs的制备是通过预乳化步骤，然后用脂相高压均质(HPH)制备的，脂相包括油酸和硬脂酸的混合物。简而言之，nlc含有适量的固体和油性脂质，表面活性剂(Lutrol 407, Tween 80，含或不含姜黄素(CRN))，如表1所示。水相的体积保持在50毫升。NLCs由空白或CRN负载组成，主要加热到脂质熔点以上。对于负载crn的NLCs，将药物溶解在3ml乙醇中，加入熔融脂质混合物中，随后分散在表面活性剂溶液(80°C)中，使用UltraTurrax T25均质机(IKA®GmbH，德国)进行处理，获得预乳液。从预乳化步骤中获得的粗分散体放置在Micro DeBee (South Easton, MA, USA) HPH中，在70°C和15,000 PSI下连续处理7分钟。最终的NLC分散体在室温下冷却，脂质结晶形成脂质纳米颗粒的固体基质。

粒径及ζ势分析

利用Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK)的动态光散射技术对得到的NLCs的粒径和ζ势进行了评估。将纳米颗粒在纯净水(分散剂)中稀释(2-3滴)，每个样品一式三份测量。

e载药量和包封效率的评价

在1 ~ 30µg/ml的浓度范围内，通过紫外-可见分光光度计在λmax为425 nm处对NLC中包封的CRN进行了测定(R2 0.999) (Douroumis 2011)。简单地说，1 ml (× 3)纳米颗粒在14000 rpm和25°C下离心30分钟。将收集到的CRN微球溶解在ACN中，测定CRN的吸光度，并选择合适的稀释度。根据公式1和公式2，确定的CRN量可提供准确的载药量(DL)和包封效率(EE):

（1） (2)

从NLCs释放CRN

通过将1ml (× 3) NLCs转移到透析袋(纤维素级，分子量为10,000)中，并在37°C下以50:50,v/v比放入含有0.5 l ddH2O和EtOH的烧杯中，估计纳米颗粒的CRN释放，类似于Yang等人[16]。将所有烧杯放入水浴摇床(Thermo Scientific Precision TSGP15D)中，在不同的时间间隔，收集溶解介质并与额外的0.5 L相同介质交换。用分光光度法测定CRN的量(λmax 425 nm)。

细胞毒性研究

LNCaP癌细胞采用Dulbecco改良Eagle培养基，添加血清(10.0%)、l -谷氨酰胺(1.0%)和盘尼西林链霉素(1.0%)，37℃，5% CO2。3天后更换DMEM培养基。

将lncap接种于24孔板中，细胞密度为1 × 106个/孔，孵育24 h后，采用MTT法评估大量CRN和CRN- nlcs的细胞毒性。每板加入适量MTT溶液(100 μl, 5 mg/ml)， 37℃孵育2 h。随后，弃用培养基，加入酸化异丙醇(200 μl)使甲醛晶体溶解，将其置于96孔板中，用微孔板读取器测量吸光度(492 nm)。CRN的浓度在10 ~ 100µg/ml之间变化。同样，以0.10、0.20、0.40、0.60、0.90 mg/ml孵育BL-NLC和CRN-NLC分散体。

细胞吸收

在24孔板上接种20 × 103个细胞/孔后，测定NLC分散体的细胞摄取。CRN-NLC样品与LNCaP细胞在不同浓度下孵育24 h。24 h后，取出细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗3次。加入1ml多聚甲醛(4%)后，将细胞置于黑暗中15分钟，将其固定在盖片上，随后将其安装在含有DAPI的屏蔽介质的玻璃载玻片上。CRC- nlcs的摄取是通过CRC荧光强度来确定的，CRC荧光强度激发于425 nm，发射于530 nm[17]。使用NIS-Elements Advanced Research软件，使用Nikon ECLIPSE 90i显微镜和Nikon (DS-Qi1Nc)数码相机采集荧光图像。成像研究采用油浸CFI Plan Apochromat VC 60 × N2。

流式细胞术分析

由于CRN固有的绿色荧光，流式细胞术定量估计细胞摄取。如前所述，将20 × 103个细胞/孔接种于24孔板的盖片上，细胞与CRN(乙醇溶液)和NLC分散体(10µg/ml)孵育24小时。丢弃培养基并用PBS洗涤三次后，加入EDTA将细胞与孔板分离。胰蛋白酶化过程结束时，细胞再次冲洗三次，分散在500 L PBS中进行分析。

体外细胞凋亡研究

简单地说，将LNCaP细胞接种于24孔板中，细胞密度为1 × 106个/孔，孵育48 h。随后，将细胞离心收集，用PBS冲洗3次，重新悬浮于1 ×结合缓冲液(500 mL)、7-氨基放线菌素(7AAD, 5µl)、PE Annexin V(5µl)中，黑暗孵育10 min。制备的样品采用Accuri C6流式细胞仪检测7AAD和PE的表达，蓝光激光(488 nm)和合适的检测器(FL1路径;530/30 nm滤光片)。从每个细胞群中获得至少10 k的门控事件，并使用Accuri软件进行分析。

LNCaP异种移植小鼠的动物研究

动物研究采用Yang等人[16]所描述的方案进行，略有不同。为了研究的目的，6-8周龄的雌性裸鼠在12小时的光照/24小时的黑暗周期中保存。LNCaP细胞在DMEM中培养，将LNCaP细胞(2 × 106)注射到乳腺脂肪垫中形成异种移植物。肿瘤生长3天(未给予治疗)，每天通过用卡尺记录两个垂直的肿瘤直径来监测体积:

将携带LNCaP异种移植物的小鼠分为各组(n = 6)，分别给予(1)空白对照，(2)CRN乙醇溶液，(3)BL-NLC和(4)CRN- nlc。每个样品经小鼠尾部静脉注射，CRN剂量为20 mg/kg。每周重复注射两次，每次200µl，持续30天。每周测量和记录两次肿瘤大小和小鼠体重。

统计分析

实验结果以均值和均值的标准差(n = 3)表示。采用t检验分析空白CRN和CRN- nlc离散度的差异，只有在概率因子p < 0.05时才认为影响有统计学意义。

目录

摘要 介绍 材料 方法 结果与讨论 结论 数据和材料的可用性 参考文献 致谢 作者信息 道德声明 补充信息 搜索 导航 #####

结果与讨论

NLC粒径与ζ势

通过调节均质温度和施加压力，成功制备了BL-NLC和crn - nlc。用于NLCs的所有材料，包括脂质、表面活性剂和油相，通常被认为是安全的(GRAS)。新制备的BL-NLC和CRN-NLC在粒径分布和ζ-电位方面进行了表征，如表2所示，但也评估了在4℃下储存6个月后的稳定性。图1显示，空白NLCs和负载crn的NLCs的粒径在110 ~ 150 nm之间变化。药物包封导致微颗粒增加约35 nm。制备的纳米分散体在空白crn负载配方中呈现单模态粒度分布。

A、C BL-NLC、B、D CRN-NLC的粒径分布和ζ-电位

HPH经过优化(数据未显示)，以产生小于150nm的NLCs，以确保其在癌症治疗中的可接受性，因为尺寸在细胞摄取单模粒径分布中起关键作用，而颗粒减小可提高生物利用度[18]。

此外，所有NLCs的多分散性指数均在0.2左右，表明种群大小均匀。测得的ζ电位为负表面电荷，变化范围为40 ~ 45mv。这些值被认为是NLC长期稳定性的指标，因为由于电斥力的作用，当ζ-值大于30毫瓦时，胶体纳米颗粒被认为是稳定的[19]。与BL-NLC(- 44.1±1.4)相比，crn - nlc(- 42.8±0.6)在6个月的储存稳定性后，其ζ电位略有下降。这种减少可以通过NLC表面的药物部分吸收导致表面活性剂的负电荷被掩盖来解释[19]。

eDL和EE的评估

进一步研究表明，CRN-NLC分散体的DL和EE分别为9.3%和92.9%。此外，负载crn的纳米颗粒的高EE表明HPH在均质化过程中包封亲脂性化合物的效率可以忽略不计药物损失。crc -NLC的DL和EE与药物的亲脂性和无序的NLC晶格有关，这有利于药物在脂质基质中的掺入[20]。DL和EE的研究结果与先前的研究结果一致[21]。

药物释放研究

利用NLC来分配CRN的可行性是本研究的主要课题之一。如图2所示，通过评估药物释放来研究NLC传递CRN的潜力。在37℃恒温下，释放试验持续120 h。由于CRN的疏水性，释放试验在50% v/v的乙醇溶液中进行，根据Kakkar等人[22]提出的CRN溶解度为0.693±0.13 mg/ml。

NLCs的体外CRN释放

CRN释放模式有两种明显的趋势。在最初的10小时内，有一个突发效应，随后在剩余的监测期间，NLCs稳定释放药物。48小时后，累积释放率为78.8%，在接下来的72小时内，这一数字增加到92.6%。这一发现与其他研究者关于脂质纳米颗粒释放CRN的研究结果一致[20]。尽管制备装载CRN的脂质纳米颗粒所使用的成分与本研究中使用的不同，但所获得的结果是合理的:NLC表面吸收的CRN导致爆发释放，而药物从NLC扩散到溶解介质所需的时间导致了持续释放[23]。

CRN的抗增殖作用

采用MTT法对LNCaP前列腺癌细胞进行细胞毒性测试，评估了负载crn的NLC制剂的肿瘤杀伤活性。我们测试了负载CRN的NLC制剂的抗增殖活性，以观察CRN在脂质基质中包封后是否保持其功效。初步研究了纯CRN对LNCaP细胞株的抗增殖活性，并比较了CRN- nlc给药体系。

如图3所示，孵育24小时后，大块CRN显示出良好的抗增殖效果。CRN呈现出癌症治疗药物中最受关注的一些特性，其中优先杀伤或治疗选择性是其中之一。因此，CRN可以选择性靶向癌细胞，同时对健康细胞的伤害最小[24]。CRN的体外抗增殖作用显著，表明CRN对LNCaP癌细胞有一定的抑制作用。

MTT法检测纯CRN对LNCaP细胞24小时的抗增殖作用(n = 3)。

NLC的抗增殖作用

当将空白NLCs用作药物时，其细胞毒性是一个至关重要的考虑因素，而具有低细胞毒性的脂质纳米颗粒则需要用于癌症应用。为了评估空白NLCs对LNCaP前列腺癌细胞的作用，我们测试了它们的细胞毒性。

空白NLCs对LNCaP癌细胞的细胞毒性无影响，如图4所示。高浓度NLC (0.9 mg/ml)孵育24 h后，细胞存活率为91.0%，但不显著[25]。

LNCaP肿瘤细胞中空白NLCs的细胞活力。(n = 3)

采用MTT法评估CRN-NLC的抗增殖作用。如图5所示，CRN浓度的增加对LNCaP细胞的存活率有影响，最低剂量为12.5 g/ml CRN浓度时，LNCaP细胞的存活率降至91.5%。

CRN-NLC在24和48 h后的细胞活力#p = 0.0323， *p < 0.0001, CRN-NLC (24 h) vs BL-NLC和##p = 0.0003， **p < 0.0001, CRN-NLC (48 h) vs BL-NLC (n = 3)

CRN- nlc的抗增殖作用在CRN浓度为50 g/ml和75 g/ml时更为明显，细胞存活率分别降至37.8%和21.4%。当剂量为100 g/ml时，细胞活力进一步降低至9.2%，与空白NLC纳米颗粒相比，这是非常显著的(p < 0.0001)。

这些结果清楚地表明，CRN-NLCs对LNCaP细胞具有剂量依赖性的抗增殖作用。然而，由于在CRN- nlc释放研究中观察到CRN的连续释放模式，我们还对LNCaP细胞进行了进一步的48小时研究，以进一步研究这一发现。

正如预期的那样，抗增殖作用在CRN孵育48小时后更为明显。在100 g/ml CRN浓度下延长孵育时间后，细胞存活率接近0%。我们的实验结果与Fang在前人研究中报道的结果相似[21]。

这种CRN-NLC的时间依赖性细胞毒性作用是CRN缓释的明确证据，也是CRN延长的NLC抑制作用的明确证据。由于空白NLCs对LNCaP细胞的细胞毒性没有影响，因此我们认为CRN分子是细胞毒性降低的主要原因。

细胞摄取的研究

CRN固有的荧光特性可以直接用于量化其细胞摄取，这是其优点之一。荧光显微镜下观察CRN-NLCs的细胞摄取;在细胞成像过程中协调激光强度、偏移量、灵敏度和增益常数，以更好地了解细胞内CRN-NLC的内化。

根据Mohanty和Sahoo(2010)的研究，已知NLCs通过内吞途径进入细胞。通过在PANC-1细胞中培养10-30 μM的天然CRC和等量的纳米颗粒制剂24小时，并在培养后进行定性细胞吸收实验，证实了它们的内化作用[26]。

实验前，用DNA特异性荧光探针DAPI对细胞核进行标记[27]，固定后获取图像。图6显示了清晰显示绿色(CRN-NLC)和蓝色(细胞核)斑块的覆盖图，显示了细胞核细胞质内CRN-NLC的内化。

载药纳米颗粒的细胞摄取，其中绿色表示crc - nclc的内化。细胞核染色呈(DAPI)蓝色。

NLCs的流式细胞术

图7流式细胞术直方图显示，CRN- nlc孵育24 h后，LNCaP细胞上CRN的积累。对于每个细胞，定量测量了信号强度，并且高比例的细胞摄取的表达与高荧光强度有关。

流式细胞术分析B - bl - nlc和B - CRN-NLC的细胞摄取

如图7所示，从直方图可以看出，CRN-NLC的信号强度为96.2%。空白NLCs也检测了自身荧光效应和对CRN-NLC产生的荧光强度的干扰。图7显示没有检测到荧光强度，而定量细胞摄取CRN-NLC的结果与荧光显微镜捕获的图像相匹配。

体外细胞凋亡

细胞凋亡是细胞生长过程中发生的一种受生理调节的细胞死亡，与坏死不同。磷脂酰胆碱(PS;位于正常细胞双分子层的细胞质侧)在细胞凋亡过程中从质膜的内叶转移到外叶[28]。

PE Annexin V和7AAD分别对未处理和处理的细胞进行染色。由于Annexin V对PS具有高亲和力，因此可以在早期检测细胞凋亡(Annexin V阳性，7AAD阴性)。7AAD联合PE Annexin V可检测早期凋亡细胞。死亡和受损的细胞可以渗透7AAD，但细胞膜完整的活细胞则不能。

用流式细胞术鉴定和量化CRN对细胞处理后的凋亡诱导，如图8所示。纯CRN (15 g/ml)可导致12%的早期凋亡细胞和24%的晚期凋亡/早期坏死细胞，而CRN- nlc纳米颗粒处理细胞。CRN- nlc (25 μg/ml CRN)处理后，细胞早期凋亡(Annexin V + 7AAD)和晚期凋亡/早期坏死(Annexin V + 7AAD +)群体分别为17.6%和18.2%。这表明，像纯CRN一样，CRN- nlcs触发凋亡通路。在50 g/ml和100 g/ml浓度较高时，凋亡细胞明显增加。CRN- nlc在50 g/ml CRN剂量下处理细胞，早期凋亡(Annexin V + 7AAD)和晚期凋亡/早期坏死(PE Annexin V + 7AAD +)的比例分别为19.8%和42.7%。与未处理和BL-NLC对照的实验显示，CRN- nlc对细胞凋亡没有影响，这表明CRN- nlc产生的细胞凋亡是由于被包封的CRN。

BL-NLC、纯CRN和CRN- nlc处理LNCaP细胞的定量凋亡分析。A通过流式细胞术评估，25、50或100 g/ml浓度的CRN-NLC处理24 h对早期细胞凋亡具有剂量依赖性。B通过流式细胞术(柱状图)检测，以25、50和100 g/ml浓度的CRN-NLC处理24小时对晚期细胞凋亡有剂量依赖性影响。(*) p < 0.05，对照vs CRN-NLC(25µg/ml)， (**) p < 0.05，对照vs CRN-NLC(50µg/ml)， (***) p < 0.05，对照vs CRN-NLC(100µg/ml)和C PE Annexin V vs 7-AAD用点图表示剂量依赖性效应。右上:晚期凋亡细胞/早期坏死细胞;左上:坏死细胞;右下:早期凋亡细胞;左下:活细胞;(n = 3)

CRN和CRN- nlc对LNCaP肿瘤的体内抗癌活性

将空白NLC、纯CRN和CRN-NLC以20 mg/kg的剂量注射到LNCaP肿瘤的小鼠异种移植物中，观察其体内抗癌活性。以1 × 106的细胞密度接种小鼠前列腺癌细胞，让细胞发育共6天，然后用各种配方开始治疗。

采用非配对t检验评估各组NLCs之间的统计学显著性差异，揭示各制剂之间抗癌功效的差异。与对照组和空白NLCs相比，CRN的抗癌活性如图9所示，数据以每组平均肿瘤组织重量表示。

对照、空白NLC、纯CRN、CRN-NLC对LNCaP前列腺癌抑瘤作用的比较

当给LNCaP肿瘤小鼠注射CRN时，与对照治疗相比，肿瘤大小减少了19%。此外，两组间的非配对t检验显示有显著差异，p = 0.020。当肿瘤小鼠被给予CRN-NLCs时，抗癌作用明显更强。

与对照组和BL-NLC组相比，用CRN-NLC纳米颗粒治疗4周后，肿瘤大小分别缩小了52%和50%。根据未配对t检验(p < 0.0001)，与对照组和空白NLC组相比，CRN-NLCs的治疗效果明显更高。比较散装CRN和CRN- nlc的肿瘤重量，发现后者的动物体重减轻了40%。这清楚地证明了使用CRN作为癌症治疗的药物输送系统的好处。

由于纯CRN和CRN- nlc纳米颗粒的动物试验显示出抗癌作用，因此根据肿瘤体积对它们进行了测量。如图9所示，与对照组和空白nlc小鼠相比，大量CRN和CRN- nlc治疗导致LNCaP异种移植物的肿瘤明显消退。图10显示了加载crn的NLC的肿瘤体积随时间变化的结果。治疗4周后，LNCaP肿瘤的平均肿瘤变异为1412.0 mm3(对照组)、1375.2 mm3(空白NLCs)、1155.1 mm3(纯CRN)和778.4 mm3 (CRN-NLCs)。与对照和BL-NLC相比，NLC-CRN表现出明显的生长抑制活性(p < 0.0001)。此外，与纯CRN相比(p < 0.0001)， CRN - nlc表现出更好的抗癌活性。另一个值得注意的发现是BL-NLC纳米颗粒的肿瘤抑制特性。图10显示，与对照治疗一样(p = 0.1300)，空白NLC没有显示出肿瘤抑制的任何实质性降低。

对照、空白NLC、纯CRN和CRN-NLC对荷瘤动物(上)的治疗影响以及CRC-NLC治疗后LNCaP肿瘤小鼠的肿瘤生长

在给药期间，对小鼠的体重进行了4周的监测，没有发现任何接受治疗的动物体重发生变化。图2S(补充数据)显示，小鼠对纳米颗粒具有良好的耐受性，没有显示出毒性或显著体重减轻的证据。

尽管已知CRN在暴露于一系列化学致癌物质的动物中具有非常有效的抗癌作用，但CRN的生物利用度却很低[29]。CRN还可以降低具有雄激素或非雄激素活性的癌细胞的细胞增殖和信号转导激活。据报道，CRN可降低组成型和诱导型核因子- b，因此具有较高的抗氧化和抗炎特性[30]。

在NLC中包封CRN可以帮助缓解与静脉给药CRN相关的一些生物利用度问题，当在肿瘤部位给药时，允许最佳的抗癌活性。根据先前的研究，药物包封可导致CRN血浆浓度增加，这可能是由于纳米颗粒的小尺寸;这反过来又促进了NLC循环时间的延长，从而可能产生更高的抗癌功效[31,32]。Chen等人(2012)也发现了类似的实验结果，给药CRN和CRN- nlc成功地减缓了肿瘤的生长，延长了小鼠的生存时间，但没有完全消除肿瘤的生长[33]。

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