摘要
使用低成本的碳基质，如农业残留物，可以大大降低生物表面活性剂生产的成本。本研究以农业废弃物中提取的米糠油为可再生碳源，利用铜绿假单胞菌PTCC 1340生产生物表面活性剂。通过薄层色谱和傅里叶变换红外光谱对该生物表面活性剂进行了表征。米糠油生物表面活性剂的产率(YRL/S)和生物质生物表面活性剂的产率(YRL/X)分别为0.246和2.81 (g/g)。此外，通过动态表面张力测量和单指数衰减模型，通过估计生物表面活性剂在界面处的弛豫时间，研究了制备的生物表面活性剂的表面活性。生物表面活性剂在降低表面张力方面表现出良好的性能，通过检测动态表面张力状态和最低吸附时间，证实了生物表面活性剂在不受盐类型或浓度影响的情况下具有良好的表面张力。研究发现，表面活性剂的浓度对生物表面活性剂在界面上的吸附/弛豫有较大的影响。该菌株制备的生物表面活性剂以米糠油为碳源，将水的表面张力从70.46降低到25.86 mN/m，临界胶束浓度(CMC)为0.09 g/L。生物表面活性剂还被发现在抑制最具破坏性的病原真菌之一的环境影响方面非常有效。生物表面活性剂增强的物理化学性能，如潜在的抗真菌性能、驱油性能和表面张力降低能力，证明了这种生物表面活性剂作为生物佐剂和化学表面活性剂在解决石油泄漏和环境净化过程中的完美替代品的潜力。
介绍
生物表面活性剂是次生代谢物，具有高表面活性、可生物降解性、低毒性和在广泛的温度和pH条件下的良好性能等宝贵特性(Geetha et al. 2018)。与其他化学表面活性剂一样，生物表面活性剂包括糖脂、中性脂、脂肪酸、磷脂、脂肽和脂多糖(Jahan et al. 2020)。应该指出的是，糖脂被认为是最熟悉的一类微生物产生的表面活性化合物。它们由长链脂肪酸、羟基脂肪酸和亲水碳水化合物组成。在糖脂类中，鼠李糖脂是最重要且被广泛研究的生物表面活性剂(Henkel et al. 2012)。由于生物表面活性剂的功能(如降低表面张力或乳液),他们有可能被用于不同的领域,包括化学、微生物采油微生物采油)石油分公司(Hajibagheri et al . 2017年,阿施施Debnath 2018年,刘et al . 2018年),溢油生物修复(陈et al . 2020),原油生物降解(Ray et al . 2022),害虫防治(Ben Khedher et al . 2017),腐蚀抑制潜在的(Verma et al . 2023年),食品和饲料包装(Zouari等人，2016)、食物垃圾堆肥表面的润湿性(Heidarzadeh等人，2022)、生物化学以及其他生物表面活性剂的应用和先进技术领域(Mozaffari等人，2021;Ghasemi et al. 2022;Sarubbo et al. 2022)。
由于底物成本高，生物表面活性剂的生产尚未工业化(Geetha et al. 2018)。使用廉价的天然可再生材料、农业和工业废物以及工业和城市废水作为替代基质有助于防止这些物质在自然界中的积累，并有助于生产增值材料(汉高等人，2012年)。这个话题已经引起了一些研究者的注意(Henkel et al. 2012;Geetha et al. 2018)。植物油、副产品和可再生农业废弃物已被用作生物表面活性剂生产的底物(Gaur et al. 2022)。在生产生物表面活性剂的各种可能底物中，植物油是最常被检查的底物之一(Jadhav等人，2019;Ghorbani et al. 2022)。一般来说，植物油是脂质的主要来源，脂质通常由相对比例的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸组成。在许多国家，只有一小部分米糠用于生产食用油，因为米糠在碾米后立即由脂肪酶的酶活性产生高水平的游离脂肪酸(Zúñiga-Diaz et al. 2017)。因此，在过去的二十年中，人们对几种植物油(包括从菜籽油、玉米、向日葵、红花、橄榄、葡萄籽、棕榈、椰子、鱼和大豆中提取的油)进行了研究，以用于生产生物表面活性剂(Henkel et al. 2012;Zúñiga-Diaz et al. 2017;Gaur et al. 2022)。Amani等人(2013)研究了P. aeruginosa MM1011在250 g/L向日葵油中作为唯一碳源生长的表面张力，发现在含有CMC为0.120 g/L的生物表面活性剂的无细胞肉汤中，其表面张力降低了26 mN/m。Mishra等人(2021)以米糠油为碳源，优化了铜绿假单胞菌MTCC 424制备鼠李糖脂生物表面活性剂的生产工艺。结果表明，优化后的生物表面活性剂在120 mg/L鼠李糖脂条件下的CMC为28.5 mN/m。他们报告鼠李糖脂产量为6.2 g/L。Moya Ramírez等人(2016)以一株生长在橄榄磨废料中的铜绿假单胞菌作为唯一碳源进行了发酵研究，并报道了生物表面活性物质的产量为29.5 mg/L。
另一方面，phaseolina Macrophomina是最有害的植物病原体之一，感染许多植物。在花生、卷心菜、辣椒、豌豆、大豆、向日葵、红薯、苜蓿、芝麻、土豆、高粱、小麦和玉米中都发现了这些真菌(Pandey et al. 2020)。几项研究已经证明了生物表面活性剂的抗真菌特性(Goswami和Deka 2019)。菜绿分枝杆菌的鉴定通常基于其形态并试图将病原体划分为亚种。然而，由于分离表型中的重要变化，这些标准中的大多数都是不可靠的(Pandey et al. 2020)。利用传统的基于培养的形态学技术对phaseolina进行错误鉴定，促使科学家改进基于高灵敏度核酸和特异性聚合酶链反应(PCR)方法的分子方法(Mirmajlessi et al. 2015)。phaseolina影响寄主根部和基部节间的纤维维管系统，阻止水分和营养物质向植物上部转移。进行性排尿、过早死亡、丧失力量和功能丧失是phaseolina m.p oelina的特征(Mirmajlessi et al. 2015)。Sathi Reddy等人(2016)研究了芒果仁油作为铜绿假单胞菌DR1生物表面活性剂生产的底物，并评估了生物表面活性剂对phaseolina m.s的抗真菌效果。结果表明，对菜绿支原体的菌丝生长抑制率为60.46%。铜绿假单胞菌从几种碳源产生的生物表面活性剂混合物中同源物的差异可能导致生物防治活性的变化。
在本研究中，碳源(包括实验室提取的农业废弃物中的米糠油、工业米糠油和葵花籽油)对铜绿假单胞菌(一种常见的鼠李糖脂产生微生物)生产生物表面活性剂的影响(Meng et al. 2019)。(见图1中当前研究的流程图)。利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和薄层色谱(TLC)对生物表面活性剂的分子结构进行了评估。此外，还测量了动态表面张力，以评价生物表面活性剂的表面活性。众所周知，表面张力随时间而变化，称为动态表面张力，它直接影响表面活性化合物的性能。由于大多数研究人员认为平衡表面张力是生物表面活性剂浓度的函数，因此在动态表面张力测量领域仍有广阔的研究空间。任何表面活性剂的表面张力的动态行为都是由化合物的极性部分引起的，表面活性分子在界面处的吸附动力学是由分子从体相到界面的运动控制的，反之亦然。除了测量平衡表面张力和测定生物表面活性剂的CMC外，本研究还旨在确定生物表面活性剂浓度对动态表面张力的影响。此外，测量的动态表面张力采用单指数衰减模型建模。据我们所知，尚无文献报道通过动态表面张力评价鼠李糖脂生物表面活性剂的表面活性。最后，考虑环境因素，研究了制备的生物表面活性剂鼠李糖脂对菜绿支原体的抑菌活性。
研究流程图
材料与方法
碳源
以农业废弃物中提取的粗米糠油为碳源，制备生物表面活性剂。米糠是在当地磨坊(伊朗Mazandaran的Babol)碾磨后收集的。米糠油和葵花籽油(食品级;石油，德黑兰，伊朗)作为比较碳源。然后将溶液在121°C下蒸压20分钟。
米糠油的提取
第一步，将收集到的米糠进行清洗和漂洗，然后在空气循环烘箱中干燥约48 h，然后将制备好的米糠与己烷以1:3的质量比混合72 h。混合后，将混合物置于索氏装置中12小时。将提取的油与1% w/w的水大力混合，以4700 rpm离心30分钟(Z 326 K, HERMLE, Germany) (Henkel et al. 2012;Zúñiga-Diaz et al. 2017)，米糠油进行了重量测量。
微生物
在这项研究中，P. aeruginosa PTCC 1340的微生物来自波斯型培养收集(IROST，德黑兰，伊朗)。铜绿假单胞菌是一种产生鼠李糖脂的常见生物。绿脓杆菌是一种需氧革兰氏阴性菌，存在于水、土壤和植被中。这种生物可以在大多数条件下生长和生存，使其成为各种过程的良好候选者。
鼠李糖脂生物表面活性剂的生产
Pre-cultivation条件
采用LB肉汤(MILLER)进行预培养(Walter 2009)。首先，在无菌条件下，将两圈细菌转移到500ml Erlenmeyer烧瓶中的100ml LB肉汤培养基中。然后将烧瓶在37°C、150 rpm的培养摇床中孵育24小时(Amani 2015)。
培养条件
无ca无机盐培养基(MSM)的组成(g/L)为MgSO4·7H2O(0.05)、KCl(0.1)、NaNO3(1.5)、Na2HPO4·2H2O(0.7862)和NaHPO4·H2O(1.1627)。将生产培养基调至pH 6.8，在121°C高压灭菌20分钟。此外，1 mL微量元素溶液通过0.22 μm膜过滤器(Merck, Germany)进行过滤灭菌。所使用的微量元素溶液为:Na3C6H5O7·2H2O 2.0 g, FeCl3·6H2O 0.3 g, ZnSO4·7H2O 1.4 g, CoCl2·6H2O 1.2 g, CuSO4·5H2O 1.2 g, MnSO4·H2O 0.8 g, pH = 7，在1l蒸馏水中。分析级化学品由默克公司(德国达姆施塔特)提供。这段时间后，在培养基中加入5%的预培养物和50 g/L的碳源，在无菌条件下，在500 mL烧瓶中配制成100 mL的溶液，在150 rpm和37℃下进行培养。每24小时收集一次样本进行分析，持续168小时(Amani 2015)。
鼠李糖脂的提取纯化
将制备的样品与正己烷(1:1 v/v)充分混合。然后在4700 rpm和4°C下离心30分钟以去除残留的植物油。然后通过添加10%的H3PO4将细胞无油肉汤调整为酸性pH值2-3。然后用等量的乙酸乙酯提取沉淀物，通过蒸发乙酸乙酯获得鼠李糖脂物质(Amani 2015)。
测量
鼠李糖脂浓度测定
利用orcinol反应辅助比色法测定鼠李糖中鼠李糖脂的浓度(g/L) (Rahman等2010;Raza et al. 2014)。以0.19%的间苯二酚为原料，在53%的硫酸中制备间苯二酚试剂。样品在4700 rpm和4°C下离心30分钟，然后稀释50倍。然后，将4.5 mL的orcinol试剂加入稀释后的0.5 mL样品中，80℃水浴30 min，冷却至室温，用分光光度计在421 nm处测量吸光度。采用鼠李糖制备的标准曲线计算鼠李糖浓度。为了获得P. aeruginosa产生的鼠李糖脂的浓度，通常将鼠李糖的量乘以3.4倍，这表明鼠李糖与鼠李糖脂之间的关系(Rahman et al. 2010;Raza et al. 2014)。
干生物量测量
将样品与等量的正己烷混合，在4700 rpm和4°C下离心30 min，以去除残留的植物油。第一步离心后获得的细胞球用0.9%氯化钠溶液(4700 rpm, 30 min)仔细洗涤。在100°C的烤箱中蒸发水分24小时后，对干生物量进行重量测量(m<s:1> ller et al. 2010)。
乳化指数(E24)
用等量的无细胞上清与十六烷混合测定乳化指数(E24)。将混合物旋转2分钟。24小时后，乳化活性测定如下(Datta et al. 2018)。
E24% =(乳化层高度/液柱总高度)× 100 (1)
驱油试验
进行了驱油试验，以确定生物表面活性剂在产生洁净区的潜力。在培养皿中，倒入30毫升蒸馏水，在水面上形成一层薄薄的油。然后加入20µL鼠李糖脂溶液，很快出现一个清洁区。对照实验使用20微升蒸馏水(Datta et al. 2018)。
生物表面活性剂生产动力学研究
在MSM中使用米糠油作为碳源进行生长谱分析，以检查在有氧培养(37ºC, 180 rpm搅拌)中细菌细胞群随时间的变化。利用分光光度计测定无油肉汤样品在600 nm (OD600)处的吸光度，确定培养物的光密度。每隔10 h测定160 h的表面张力降低(生物表面活性剂生产)和米糠油利用率。米糠油利用率表示为米糠油减重率除以初始重量。每个数据点至少重复三次，以保证试验的重复性和准确性，并报告平均值。
生物表面活性剂的化学性质
用FTIR (TENSOR 27, Bruker, Germany)对所得物质的分子结构进行了评价，用薄层色谱(TLC)对鼠李糖脂进行了纸上分离;No.105554, Merck)根据其疏水性使用特定试剂。以体积比为65:15:2的氯仿、甲醇和乙酸的混合物为检测相和流动相。以体积比为100:2的醋酸与硫酸二元混合物为静息相(Amani et al. 2010a)。
e所制生物表面活性剂的表面活性评价
表面张力测量
生物表面活性剂最重要的特性之一是降低表面张力。在本研究中，使用了自动表面张力测量设备(Atiyeh Pouyandegan Exir Technologies Co. [Apex Technologies Co.]， Arak, Iran)。动态表面张力采用垂滴法测量，这是最精确的表面张力测量技术之一(Yang et al. 2014)。使用捕获系统监测含有生物表面活性剂的垂坠液滴的形状。使用在线图像处理软件对捕获的垂坠图像进行分析，公式如下(Berry et al. 2015):
（1）G是重力加速度Δρ是空气密度和水滴密度之差。此外，H是依赖于形状因子值的形状相关参数，即S = d/ d (Berry et al. 2015)，该参数是通过图像处理实验测量的。需要注意的是，D为垂坠液滴的赤道直径，D为距液滴顶部D处的直径。为了检查测量的可重复性，报告了至少三个独立测量的平均值作为平衡表面张力值。值得注意的是，在达到平衡点之前，表面张力(动态表面张力)随时间的推移而减小，即平衡表面张力不受界面时效时间的影响。根据动态表面张力值和单指数衰减模型计算吸附时间。
Mono-expo本质衰变模型
通常情况下，生物表面活性剂分子可以随时间从体向界面迁移，从而影响动态和平衡表面张力行为，这与高吸附活化能势垒有关。一般来说，当扩散部分大于动力学部分时，扩散可以控制活性剂的吸附。当吸附受到活化能的限制时，提出了一个衰减模型来模拟表面张力和界面张力值随时间的变化(Lashkarbolooki et al. 2017)。衰变模型经常用于评估动态地表活动(Lashkarbolooki et al. 2016;Hamidian et al. 2019)。
（2）式中，γe、γt和γ0分别为平衡态、t时刻和初始时刻(t = 0)的表面张力。模型的可调参数τ是一个以吸附时间为单位的参数，可以通过拟合实验动态表面张力值来获得。
临界胶束浓度
生物表面活性剂的关键特征之一是它的CMC，它表示胶束形成的开始。表面张力不能通过添加超过CMC值的额外生物表面活性剂来降低。通过测试不同浓度的生物表面活性剂溶液的表面张力值来计算CMC值(Kłosowska-Chomiczewska et al. 2017)。
盐的种类和co的影响浓度对生物表面活性剂的活性
研究了不同盐(MgSO4、Na2SO4、KCl和NaCl)及其浓度对鼠李糖脂表面活性的影响。在含有鼠李糖脂的上清液中加入不同浓度的每种盐(2-12% w/v)，并测量其表面张力。
米糠油生物表面活性剂的抑菌作用
phaseolina是最有害的种子和土壤传播的植物病原体之一。研究表明，该物种可以在土壤中存活长达三年(Kaur et al. 2012)。因此，对生物表面活性剂的抗真菌活性进行了研究，主要是在食品和制药工业中应用。马铃薯葡萄糖琼脂;3.9 g)溶解于100 mL蒸馏水中，在121℃下蒸压20 min，然后用0.22 μm膜对0.2、0.1、0.05 g/L浓度的生物表面活性剂进行过滤灭菌。滤液加入熔融PDA培养基中，25℃孵育24 h，确保培养皿未被污染后，将phaseolina菌丝塞置于培养皿中央培养。培养皿在25℃下孵育4天。研究鼠李糖脂对菜绿支原体的抑菌活性。所有检测均为三份(Santos et al. 2021)。