摘要

利用16000 keV (λ = 0.77 Å)采集的低温100 K同步x射线数据，以0.85 Å分辨率测定了牛胰核糖核酸酶A的晶体结构。这是首次报道的核糖核酸酶a天然形式的超高分辨率结构。利用各向异性位移参数、立体化学约束、计算位置包含的H原子、5个\({\text{SO}}_{4}}^{2 -}\)基团、11个乙醇分子和293个水分子进行细化，最终R值为R1(Free) = 0.129(4279次反射)和R1 = 0.112(85,346次反射)。精炼后的结构以结构7p4r的形式存储在蛋白质数据库中。使用四种高分辨率结构对保护水域进行了调查。聚类分析确定了与牛核糖核酸酶A活性位点相关的水分子簇，特别注意将目前的结构与其他高质量牛胰腺核糖核酸酶A的x射线晶体结构进行了详细的比较，特别参考了沉积的经典单斜结构3RN3 Howlin等人(Acta Crystallogr A 45:851-861, 1989)。针对活性位点残基Lys-1、Lys-7、Gln-11、hys -12、Lys-41、Asn-44、Thr-45、Lys-66、hys -119和Ser-123，对氢键和构象的各个方面进行了详细研究。对于活性位点的两个组氨酸残基，初始电子密度图清楚地证实了His-12在正交结构上的位置与3RN3非常相似。在3RN3中，His-119表现出较差的电子密度，这被建模和精炼为两个不同的位点，A(65%)和B(35%)，但相对于目前超高分辨率正交结构中的His-119，它有明显的电子密度，被建模和精炼为一个不同于3RN3中构象A或B的单一构象。其他感兴趣的点包括丝氨酸-32，它在侧链的末端以目前的正交形式无序，但在3RN3中被建模为单一形式。赖氨酸-66:有密度表明可能的构象的残基。但密度相对较弱，构象不清楚。研究了三种氨基酸在超高分辨率电子密度中的表现:(i)具有非常清晰的分辨特征，例如Lys-37;(ii)分辨率高，但明显分为两个构象，在精化过程中表现良好，都具有高质量的几何形状，例如Tyr-76;(iii)密度差，难以或不可能建模，例如Lys-31，除Cβ外，其密度缺失。一般认为Gln-11、His-12、Lys-41、Thr-45和His-119的侧链与酶活性密切相关。lys7、Asp-44、lys66、ph -120、Asp-121和Ser-123也可能在这一机制中发挥作用。对这两种结构的分子动力学研究研究了His-119的构象，该构象在3RN3中被建模为两个构象，但在目前的正交结构中被观察到具有单一的明确定义的构象。MD也被用于研究Lys-31、Lys-41和Ser32。本研究和3RN3中使用的核糖核酸酶A (Howlin et al. in Acta Crystallogr A 45:851-861, 1989)的形式包括一个硫酸盐阴离子，其位置与蛋白质核苷酸复合物中的\({\text{PO}}_{4}^{2 -}\)磷酸基大致相同(Borkakoti et al. in J Mol Biol 169:743-755, 1983)。该结构包含5个\({\text{SO}}_{4}}^{2 -}\)基团SO41151-SO41155，其中SO41152和SO41153为无序基团，SO41152位于活性位点，11个EtOH分子EOH A 201-EOH A 211均具有良好的几何结构。氢原子被几何地嵌入到乙基羟基分子中。这里包括本结构中这些特征的说明。硫酸盐大概存在于为本研究购买的材料中。目前的结构中包含293个水分子，而3RN3中包含134个水分子(Howlin et al. in Acta Crystallogr A 45:851-861, 1989)。

介绍

核糖核酸酶A是最早用x射线晶体学研究的酶之一。牛胰腺核糖核酸酶A的两个独立结构分析在蛋白质晶体学的历史上很早就被报道过，这两个分析都没有包含基于其结构模型的原子坐标:第一个由Kartha等人[1]，第二个由Carlisle等人[2]。1982年，Borkakoti等人在1.45 Å分辨率下对牛单斜结构进行了最小二乘改进。[3]是从1982年Wlodawer[4]发表的原子参数开始的，这些原子参数来自联合x射线衍射研究(2.5 Å)和中子衍射(2.8 Å)。Borkakoti等人[3]报道了活性位点几何形状、硫酸盐分子位置、氢键、分子间接触和溶剂结构的研究结果。1989年Howlin、Moss和Harris[5]以Borkakoti等人[3]的1.5 Å模型为出发点，报道了应用刚体TLS模型进行分段各向异性细化的结果。这些结果后来以结构3RN3的形式存储在蛋白质数据库中[5]，并与目前0.85 Å正交形式的改进结果进行比较。牛胰腺核糖核酸酶A的氨基酸序列如图1所示。Vergara等人[6]最近对单斜RNase A进行了研究，但没有任何迹象表明本文在论文标题或PD Bank沉积中包含了对RNase A结构的高分辨率研究。2002年，Berisio等人[7]发表了基于蛋白质晶体衍射模式延伸到原子分辨率的假设的工作，该假设保证了分子结构的非常精确的图像，并使与蛋白质功能相关的微妙现象的研究成为可能。牛胰腺核糖核酸酶A在pH*值5.2、5.9、6.3、7.1、8.0和8.8以及分辨率限制在1.05-1.15 Å范围内的6种结构得到了细化。本文对六种结构的总体描述和几个方面进行了描述，主要是关于ph触发的构象变化。由于预计会有细微的变化，因此首先对六个改进模型进行了彻底的验证评估。一些立体化学参数，如n -C - α-C角和羰基C原子的锥体化，表明精炼中通常使用的标准目标值及其重量可能需要修改。六种结构的详细比较为Lys41在催化中的作用提供了实验证据。此外，还深入研究了活性位点中硫酸盐阴离子的ph依赖性结合的结构效应，硫酸盐阴离子模拟了RNA的磷酸基团。最后，这些结果支持了一些关于Cys65和Cys72之间的二硫桥在RNase a折叠中的作用的热力学和动力学实验数据。

牛胰核糖核酸酶A:氨基酸序列。Gln-11、His-12、Lys-41、Thr-45和His-119的侧链通常被认为与酶活性密切相关。lys7、Asp-44、lys66、ph -120、Asp-121和Ser-123也可能在这一机制中发挥作用。此图除S-S桥外没有其他结构元素

正如“核糖核酸酶A晶体的x射线数据处理”中所描述的，目前已经收集了原生形式的正交核酶A的超高分辨率数据。1997年，Dung和Bell发表了一种1.6 Å结构的正交核酶A[8]，其结构与目前的结构具有相同的空间群和相似的单位细胞参数。这两种正交结构的详细比较将在其他地方发表。这里描述了这两种正交结构的一些特征，以便进行比较和对比。目前，已经在讨论的三个高分辨率壳层中生成并检查了超高分辨率构造图。数据之间没有显著差异，因此将部分数据包括到0.85 Å没有不利影响，并且在随后的细化阶段被包括在内。使用挥发性母液使这些晶体不适合室温数据收集和使用HC1装置进行晶体脱水。在获得100 K的超高分辨率数据后，没有理由进一步追求这一点。

结构RMSD的比较

Caterino等人[6]辐射损伤研究中的结构与本文描述的结构(id 7P4R)相叠加，他们报道的第一个和最后一个结构的RMSD分别为0.65和0.67埃。在这两种情况下，124个残差被用来计算RMSD，除非另有说明，否则所有其他后续叠加都是如此。活性位点残基(His 12, Lys 41和Lys 119)非常相似，除了第二个His和Lys残基顶端有分叉。在第36 ~ 40和64 ~ 71环上也有差异，在第21环上也有差异。其中大多数与外围活性部位接触有关。

看看Mazzarella等人[7]的异天冬氨酸残留在67处的结构，这与上面的比较相似，在包含突变的环中差异更明显。因此，122个等效残留物的RMSD较高，为0.77埃。

从pH值为5.2 (RMSD 0.53埃)的1KF2到pH值为7.1 (RMSD 0.54 A)的1kf5和pH值为8.3 (RMSD 0.57 A)的1KF8的pH系列结构(也是由Mazzarella绘制的)。值得注意的是，这些结构都与本研究中报道的结构非常相似。

7P4R结构是唯一的正交结构，其余都是P21结构，所以尽管空间群不同，但相似性似乎很好。

材料与方法

材料

日博核酸酶一

牛核糖核酸酶A型2A以白色粉末的形式购自Sigma。

结晶

通过将约100毫克粉末状核糖核酸酶A溶解于1毫升蒸馏水中获得晶体。粉末完全溶解后，向溶液中加入2ml冰冷的无水乙醇。然后将溶液置于4摄氏度。两周后获得针状晶体。核糖核酸酶A晶体呈长针状，长约500微米，长约50微米，宽约50微米。见图2。

一颗RNase A晶体，安装在Diamond用于数据收集

x射线数据收集

钻石光源，MX光束线I02

用于数据收集的核糖核酸酶A晶体在4°C无水乙醇中生长。对结晶母液进行了测试，当闪冷至100k时，母液表现为玻璃。因此，没有进一步的冷冻保护添加到晶体中。一袋16个晶体被冷却并装入样品交换器。每个晶体用三次测试镜头筛选，间隔45°，曝光0.5 s，振荡0.5°。在16000 keV (0.77 Å)下采集数据，检测器尽可能靠近样品(179.5 mm)。当衍射数据显示为1.5 Å或更好的数量级时，收集数据。采用EDNA策略[9]获得起始角度，振荡0.1°，曝光0.1 s，采集180°数据。

Ribo的x射线数据处理核酸酶A晶体

使用Fast_dp和Xia2在波束线上自动整合和缩放数据[10]。这突出了第十二晶体衍射到最高的分辨率。对数据进行人工处理，使用XDS[11]进行积分，使用Aimless[12]进行缩放和合并强度。手动缩放的目的是优化包含的数据，以最大限度地提高最终分辨率。定义截断数据的分辨率是一个有争议的问题。在这种情况下，数据延伸到探测器的角落，导致外壳的完整性低。然而，在外壳中有一个信号，分辨率为0.85 Å，因此有三个。MTZ文件可供分析:

• 数据缩放合并为0.85 Å。

• 数据缩放合并为0.87 Å。

• 数据缩放合并为0.89 Å。

在随后的分析中使用0.85 Å数据集。

结构解细化

使用MOLREP进行分子置换[13]，采用已发表的结构3RN3。pdb[5]。最后的细化使用REFMACS进行[14]。

目录

摘要 介绍 材料与方法 结果 结果 公司的研究 nserved水域 正交RNase A的分子动力学研究 正交RNase A的附属位点分析 数据和材料的可用性 参考文献 致谢 作者信息 道德声明 补充信息 搜索 导航 #####

结果

空间群:P212121(19)和单位细胞:a = 43.9980 a, b = 45.6970 a, c = 51.8900,α= 90°,β= 90 o,γ= 90°。

使用COOT程序进行模型检查和重建[15]，使用PHENIX程序进行进一步的各向同性细化[16]。在精制结束时，使用PHENIX提供的自动化方法加入水分子[16]。使用程序REFMAC5迭代地进行正交核糖核酸酶A晶体结构的改进，并在COOT[15]中穿插与CCP4i2套件[17]相关的几轮人工构建和验证检查。将H原子置于顺行位置，并对所有非H原子进行各向异性温度因子的细化。观察到一些残基具有有序或清晰的多重构象，并被构建到结构中，其相对占位率总和为1.0。在最后的步骤中加入溶剂和配体。最后在PDB_REDO服务器上对两者的大分子结构模型进行优化[16]。在细化结束时，R因子和R自由(所有数据)分别为0.112和0.129。使用dynamama程序[18]进行结构验证。检查Ramachandran地块(见附加文件1:图1)。S1和S2)表明96.77%的残基位于有利区域。坐标和数据已存储在蛋白质数据库中，识别码为7p4r。表1总结了改进的统计数据。

结果

im的详细信息重要的结构特征和选定的残基

目前，牛胰核糖核酸酶A的超高分辨率结构与单斜结构3RN3相比，揭示了许多有趣的差异[5]。首先，对氢键的各个方面进行了详细的研究，特别是针对以下活性位点残基:Lys-1、Lys-7、Gln-11、hys -12、Lys-41、Asn-44、Thr-45、Lys-66、hys -119和Ser-123。对于活性位点的两个组氨酸残基，初始电子密度图清楚地证实了His-12在正交结构中的位置与3RN3中的位置非常相似，但对于超高分辨率结构中的His-119来说，电子密度很明显，但侧链占据的单一构象不同于分子替代模型3RN3中的分叉位点a或B。其他感兴趣的点包括丝氨酸-32，它在目前的正交形式中具有双重构象，但在3RN3中被建模为单一形式。赖氨酸-66:密度好，主要构象呈延伸状，次要构象呈盘绕状。

ala - 64 -半胱氨酸- 65 -赖氨酸- 66

图3a显示了Lys-66在正异性核糖核酸酶A中的延伸的主要构象。该残基具有良好的清晰电子密度，其模型主要为单一构象，但末端有一个小分支。x射线模型分为如图所示的大a部分(67.5%)和小B部分(32.5%)。A和B只能在链的末端区分。这里的A链有一个延伸的构象。图3b显示，单斜RNase A 3RN3[5]存在Lys-66的单一卷曲构象。三个侧链扭转角(度)分别为:正交:- 167.88,178.29，- 162.23扩展;[5]单斜:−148.54,9.22，-58.80。

序列Ala-64-Cys-65-Lys-66:一个正同源核糖核酸酶a，显示了Lys66的延伸主要构象。b单斜RNase A 3RN3显示Lys-66的单螺旋侧链构象。水氧以红色球体表示;氢键用虚线表示;乙醇EOH a205分子通过一个水分子以正交形式与Lys-66侧链相连;这个乙醇还连着Asn-62和Ser-123。用Biovia绘制[19]。注:认为Lys-66可能在酶机制中起作用

表2给出了序列Ala-64-Cys-65-Lys-66的主链扭角φo和ψo。这表明(从表中向下阅读)，3RN3[5]和Orthorhombic RNase A在该区域的主链构象是高度保守的。如图3所示，Lys-66在0.85 Å分辨率结构中的侧链构象是延长的，而在单斜3RN3[5]结构中，侧链构象是卷曲的。

Lys-31–Ser-32–Arg-33

Lys-31和Ser-32已经在正交结构中建模，每个都有2种可选的构象，占用率分别为A 62.6%， B = 37.4%， A = 76%， B = 24%，而3RN3中只有单一构象[5]，图4a, B。较小的侧链构象用蓝色表示。在α-螺旋形成的可接受区域内，正构RNase A的主链构象φ = - 41.45°，ψ = - 57.59°，3RN3的主链构象φ = - 28.71°，ψ = - 64.01[5]非常相似。图4c显示了正交结构中的两种Ser-32构象。

α螺旋末端序列Lys-31-Ser32-Arg-33的构象(a)正交RNase和(b) 3RN3。详细信息:一个正交RNase a Lys31-Ser32-Arg33序列，显示Lys-31的主要构象(62.6%)和次要构象(蓝色)(37.4%)，Ser32的主要构象(76%)和次要构象(蓝色)(24%)(由Biovia绘制[19];b单斜rna酶A 3RN3[5](与Biovia一起绘制[19]);c正构核糖核酸酶A Lys-31A -Ser-32-Arg-33序列显示ser - 32a(主要76%)和B(次要24%)构象。用水星绘制[20]。注:正构体Ser-32A的主要构象与3RN3中的Ser-32非常相似[5]。b该序列的主链构象具有显著差异，如下表3所示

他- 119和

在超高分辨率正交结构中，残基His-119的电子密度明显，其占据单一有序位点，但侧链在分子替换模型3RN3[5]中占据两种不同的构象，a位占65%，B位占35%(图5a, B)。His-119也是下文“活性位点细节”中描述的活性位点的重要组成部分。

a正交rna a: His-119占据一个位点。这个结构是无序的。只显示了主要的A站点。用Biovia绘制[19]。b 3RN3 [5] His-119:主要位点A(65%)和次要位点b(35%)。这是预定的。与Biovia一起绘制[19]

12

图6a为正交RNase A活性位点的局部视图，图6b为3RN3活性位点的局部视图。有趣的是，Gln-11的构象似乎发生了变化(图6a, b)。然而，似乎是为Gln-11选择的模型造成了这种明显的差异，因为构象本身没有改变，见图6。His-12是活性位点残基的重要组成部分，“the active site details”。在正交RNase中，his - 12h直接或通过水分子与基团结合。Gln-11氢键通过水分子和NδH1直接通过NδH2。在3RN3[5]中，His-12氢键与2个水分子结合，Gln-11氢键与Oδ结合。然而，两种RNase A形式之间的Gln-11侧链构象似乎没有变化，并且H原子已经用Biovia模拟成3RN3[19]。因此，很可能是3RN3中的Oδ和Nδ发生了交换，使得两种形式之间的氢键模式更加相容。图6更详细地说明了这一点。

(a)正交RNase a和(b)单斜RNase a 3RN3[5]的活性位点，显示Gln-11和His-12基团和水。氢键被破坏了。在正交RNase A中，his - 12h直接或通过水分子与基团结合。Gln-11氢键通过相同的水分子直接通过另一个NH基团。在3RN3中，His-12形成类似的氢键，Gln-11使用Oδ而不是Nδ。构象是相似的。基团在正交结构中无序分为两个基团。电子密度图清晰地定义了His-12在正交模型中的位置，与3RN3中的位置非常接近(b)(使用Biovia[19]绘制)。

活动站点的详细信息

本研究和3RN3[5]中使用的核糖核酸酶A酶的形式包括一个硫酸盐阴离子，它与蛋白质核苷酸复合物中的磷酸基占据大致相同的位置[21]。目前的结构包含另外4个基团，其中两个是无序的。Lys-7、Gln-11、His-12、Lys-41、Asn-44和His-119被认为是重要的活性位点残基。在正交结构中，Lys-7、Gln-11、His-12、Asn-44和His-119占据单个位点，而Lys-41无序进入位点A和B，基团进入位点A(60%)和B(40%)。在3RN3[5]中，Lys-7、Gln-11、His-12、Lys-41、Asn-44和基团占据单个位点，而His-119紊乱为A位点(65%)和B位点(35%)。这些残留物的位置如图7所示。如图7所示，许多水分子也起到稳定结构的作用。图7显示了His-119基团与活性位点部分相互作用的更多细节:(a)显示了正异性核糖核酸酶a中的单个His-119如何连接到主要位点;(b)显示了3RN3中的His-119 a和b如何连接到单个位点。在正交活性位点有4个水，在3RN3有6个水。两个活性位点都由11个氢键稳定。

活性位点的结构:(a)正交RNase a . b . 3RN3[5]。c在正构RNase A的电子密度中，His-119有明显的单一构象。d His-119 3RN3的电子密度质量较差，显示出65%和35%的两种构象

如图7a所示，A位点的氢键与His-12和Gln-11结合，b位点的氢键与Gln-11、His-119和一个水分子结合。His-12也被Asn-44稳定，Lys-41A与Asn-44的氢键和Gln-11和Lys-41B被2个水分子稳定。Lys-7氢键与b相同的水分子，图7b为3RN3 [5];His-119(A)氢键与水分子相连His-119(B)氢键与水分子相连。也被三个水分子和His-12, Gln-11和His-119A稳定。Asn-44通过一个水分子与His-12和Lys-41形成氢键Lys-7与Gln-11形成2个氢键Gln-11也与一个水分子形成氢键。这两个组装的活性位点似乎都形成了相当稳定的单元，没有明显的理由来解释3RN3中His-119的正交结构紊乱。与3RN3中的His-119有关的进一步细节见“His-119和”和图4。如图6所示，正如Borkakoti等人[3]报道的那样，在正斜型核糖核酸酶A中，Gln11 ε而不是ε与SO4相互作用，单斜型核糖核酸酶A与Biovia[19]。图7c显示了His-119在正交RNase A电子密度中的清晰的单一构象。图7d显示His-119 3RN3的电子密度质量较差，显示两种构象65%和35%的建模。

正交Ribo中α-螺旋和β-片状结构核酸酶一

正交Ribo中的α-螺旋核酸酶一

Borkakoti等报道单斜链核糖核酸酶A结构3RN3[5]中存在三个螺旋区域:α-螺旋I残基3-13、α-螺旋II残基24-33和α-螺旋III残基50-60;βI残基42 ~ 48，βII残基71 ~ 92，βIII残基94 ~ 114。

下面是对正交核糖核酸酶A的这些特征的检查。

α螺旋区域

正构核糖核酸酶A的螺旋区如图8a、i和ii、b、c所示，其Ramachandran图见附加文件1:图S1、S2和S3。除了下面提到的例外情况外，Ramachandran图表明，对于所有三个螺旋，主链(φ， ψ)值都精确地位于通常称为α-螺旋的区域内。在αI Gln-11和His-12 (φ， ψ)值都位于该区域之外的情况下，His-12是最远的。有趣的是，α-螺旋I通过Met-13和Arg-33之间的氢键与α-螺旋II相连，图8a (II)， d，两个螺旋方向相反。

a (i) α -螺旋II正同形核糖核酸酶a (II) α -螺旋II正同形核糖核酸酶a显示Arg-33和Asn-34 h键在螺旋的一侧。b α-螺旋II覆盖残基Asp-NH2-24至Arg-33。Asn-24上有2个水和一个EtOH, Asn-27和Gln-28上有2个水，Met-30、Lys-31和Ser-32上有1个水[未示出]。c α-螺旋III覆盖残基Ser-50至Gln-NH2-60。SOE1168氢键与Ser-50和Leu-51都成键。许多水分子沿着螺旋与残基形成氢键[在图c中可以看到至少15个]。用Biovia绘制[19]。d正交RNase a中α-螺旋I和α-螺旋II之间的氢键连接，箭头表示每个螺旋的方向相反。α-螺旋II上有一个乙醇分子EOH A 204 h键与Asp-NH2-24成键。与Biovia一起绘制[19]

正交Ribo中的β-sheet区域核酸酶一

三个β-薄片区域如图9a所示，并在附加文件1:图S4中显示了一个组合Ramachandran图。这三个区域覆盖残基(I) 42-48、(II) 71-92和(III) 94-110。图9a中的箭头表示β-sheet结构组件大致平行。红色数字表示特定地点的水域数量。由6个残基组成的β-sheet I共有4个水，β-sheet II有27个水，有21个残基，β-sheet III有22个水，有16个残基。由43个残基组成的整个β-片区域只吸引53个水，而完整的蛋白质分子有124个残基和300个水。在这53种水中，15种与β-薄片II中的4个残基相连，14种与β-薄片III中的4个残基相连。换句话说，29个水只与9个残基相连，34个水分布在剩下的24个残基之间。这意味着，该地区的大部分地区可能几乎没有水。

a正交RNase a的β-片区。这表明在组装体的中心区域，3个β-片是近似平行的。红色数字表示该地点的水域数量。有几个延伸段没有水:特别是β-薄片I中的42-43和46-48;β-表II中的99、100、101、102。用Biovia绘制[19]。b显示了β-Sheet I如何通过其残基之一His-12与活性位点紧密相连(“活性位点细节”)。活性部位硫酸盐为SO41152。pdb文件，EtOH为eoha203。c显示了这种结合是如何通过与β-Sheet II和β-Sheet III的氢键进一步加强的。因此，β-片结构和α-螺旋结构对活性位点的稳定性有重要贡献。EtOH为eoha203

图9b, c显示了β-sheet I如何通过其残基之一His-12与活性位点紧密相连(“活性位点细节”)，图9c显示了这种联系如何通过与β-sheet II和β-sheet III的氢键进一步加强。因此，β-片结构和α-螺旋结构对活性位点的稳定性有重要贡献。

氢键

蛋白质-蛋白质和蛋白质溶剂H-bo在正交rna酶A中结束

在晶体不对称单元中，通过立体化学检查和WinCoot 0.7显示的电子密度评估，共分配了293个水分子位置[15]。这些都成功地包含在各向异性热位移参数的细化中。水的氢原子是几何固定的。利用Accelerys Discovery Studio 3中的Biovia对水分子和124个肽主链和侧链原子的氢键性质进行了分析[19]。蛋白质-蛋白质和蛋白质-溶剂氢键的数目列于附加文件1:Table S2。对于一个给定的残基(侧链或主链)，相互作用的次数从0到6不等，蛋白质-水相互作用的次数也从0到6不等。总共观察到299个蛋白质-蛋白质h键，对应于每个残基2-3个蛋白质-蛋白质h键，总共观察到133个蛋白质-水h键，这意味着只有大约40%的水分子参与蛋白质h键，或者超过60%的水分子不与蛋白质残基相互作用。

在晶体结构中存在许多其他溶剂化物:5个离子标记在。SO41151、1152、1153、1154和1155等11个乙醇分子EOH A201与EOH a211形成氢键，其中EOH A201、A202、A204和A206与蛋白质侧链原子形成密切接触，a203、a205和a208与水相结合。

附加文件1:表S1列出了正交核糖核酸酶a中每个残基的蛋白质-蛋白质和蛋白质溶剂氢键的数目。附加文件1:表S2总结了含有m个蛋白质-蛋白质和n个蛋白质-水氢键的残基数目。例如，参考附加文件1:表S1显示Ser-21没有这两种类型的键(m = 0和n = 0)，并且总共有10个残基具有1个Protein-Protein和1个Protein-Water氢键(另见附加文件1:图S6, S7)。

氢键形成的例子

1. 1.

   Arg-10

   如图10a、b所示，Arg-10与5个氨基酸残基形成氢键:glu2、Ala-6、Lys-7、Arg-33和Asn-34。Arg-10是α -螺旋I的一个组成部分(残基3-13)。

2. 2.

   Thr-45(图11)。这是一个简单的氢键例子。一个水分子与Asn-44侧链上的两个原子形成氢键，另外两个水分子与相邻的位于β-sheet II上的Thr-45侧链形成氢键。

3. 3.

   残基Asp-14至Thr-17位于α-螺旋上。显示了支撑螺旋结构的氢键。

4. 4.

   正交RNase A序列Gln-69-Thr-70 - Asn-71。在正交RNase A中，Gln-69和Asn-71都有延伸构象。Asn-71中存在一个氢键，为主链(NH) -侧链O=C(图13a)。在3RN3[5]中，Gln-69现在具有具有2个氢键的卷曲构象:一个侧链-侧链(自身)，一个侧链-侧链(Asn-71)。Asn-71还有2个在正构RNase A中不存在的氢键，一个侧链-侧链，另一个氢键主链-主链(图13b)。

这表明在正交RNase a中的残基Arg-10 (a)和3RN3中的残基Arg-10 (ii)存在一些不寻常的氢键[5]。在这两种结构中，Glu-2与Arg-10形成2个侧链-侧链氢键。Ala-6和Lys-7分别与Arg-10形成一个主链-主链氢键。Asn-34形成一个主链-侧链氢键。Arg-33形成一个侧链-主链氢键和三个主链-侧链键。残基间共有9个氢键。Arg-10是α-螺旋I末端的一个组分残基(残基3-13)，有趣的是它与溶剂分子没有形成任何氢键。b在3RN3中，Arg-33和Asn-34与Arg-10之间形成类似的氢键。Ala-6不与Arg-10相互作用，但Glu-2和Lys-7都与Arg-10形成氢键，这与正交RNase A中的氢键不同。在3RN3中，两个水分子与Arg-10形成氢键，一个水分子与正交RNase A Asn-34形成氢键。与Biovia一起绘制[19]

这显示了Thr-45和两个水分子之间的直接氢键

正交RNase A. Asp-14至Thr-17残基位于α-螺旋i上，显示支持螺旋结构的氢键。SOE1168氢键到Ser-15

正交RNase A. Gln-69与Asn-71的比较

正交RNase A中的水斑和空隙

1. 1.

   c端到n端区域

   从图14a可以看出，在正交RNase a的c端Lys-1和Pro-114之间靠近n端的区域有明显的水分子聚集，SO42-1041位于该区域。这种水的积累可能有助于稳定该区域的蛋白质结构。图14b显示了3RN3[5]中相应的区域，在该区域已经找到了一些水分子，但符合趋势，在两种结构的对比中，总的来说发现的水分子数量要少得多。

2. 2.

   区域His-105-Cys-110水空洞

   图15显示了Ala-102和Glu-111之间的RNase A结构区域(A)正交RNase A和(b) 3RN3。在这两个地区，在His-105到ys-110都没有水的迹象。参见附加文件1:表S1，其中该空白可以定位。其他的水洞在检查中也很明显

3. 3.

   区域Lys-1至Asn-34水空洞

   图16a、b是通过改变正交RNase A的条带结构位置并检测其含水量而得到的。在Lys-1和Asn-34之间有一个清晰的斑块，并向蛋白质结构的边界突出，这是无水的。要想更清楚地看到这个区域，就需要观察分子的晶体排列。这个补丁可能有结构上的原因。

RNase A结构c端入口处的水斑:(A)正交;3 rn3 (b)

无水补丁his -105 - ys-110

a正交RNase a的无水斑块I位于Lys-1和Asn-34之间(第一张视图)。b.无水斑块的第二视图，包括螺旋α-螺旋I和螺旋II。其他溶剂分子在a和b中都有显示

蛋白质和蛋白质溶剂氢键的数目

附加文件1:表S1列出了正交RNase A的每个残基中存在的蛋白质-蛋白质氢键的数量以及涉及哪些残基，存在的蛋白质-水氢键和其他蛋白质-溶剂氢键的数量。除了300个水分子外，每个不对称单元还有3个离子、2个硫酸乙酯分子(SOE)和7个乙醇分子。其中一些与蛋白质残基形成氢键。这些列在附加文件1:表S1中。

一般评论:大多数蛋白质-蛋白质氢键(6)发生在Ser-80。其他几个残基有5个，这些是Arg-10, His-12, Asp-14, Gln-55, Gln-60, Ser-80和Gln-101。大量的残基是缺乏蛋白质-蛋白质相互作用的。Ser-21没有任何氢键。在前面几节给出的例子中有氢键形成的例子。附加文件1:表S2提供了具有给定氢键数的残基数的完整列表。

正交RNase A中的盐桥

表4列出了在正交RNase A结构中观察到的五个盐桥所涉及的残基以及相应的盐桥长度。图17显示了残基Arg-10和Glu-2之间盐桥的例子。

显示Arg-10和Glu-2之间的盐桥1。一些水已经包含了氢键到Glu-2。与Biovia一起绘制[19]

肽侧链电子密度和构象的研究

肽侧链电子密度与co在正交RNase A和3RN3中的信息

众所周知，使用冷冻晶体的x射线衍射数据得出的超高分辨率蛋白质结构通常显示氨基酸残基显示不止一个有序构象。例如Smith等人[22]、Addlagatta等人[23]和Lisgarten等人[24]。当这种效应被观察到时，有可能使用这些苛刻的高速实验条件既导致又允许这些替代结构被捕获以进行详细检查。也有可能这种替代构象可能对蛋白质的生物活性有影响。

正交RNase A和3RN3的电子密度性质

正交RNase A和3RN3[5]的电子密度性质在图18a和b中以颜色编码总结，在附加文件1:表S3中有更详细的描述。

(a)正交RNase a和(b) 3RN3氨基酸建模与电子密度质量的对应分析[5]。颜色代码:白色=高质量的电子密度，在模拟清晰的单一构象时问题最小;绿色=两种不同构象的清晰电子密度模型;红色=非常弱或缺少电子密度;蓝色=无序

正交rna A

正交RNase A的电子密度质量非常高(图18a中主要为白色)，在拟合氨基酸残基结构方面几乎没有问题。13个残基完全或部分倍增(格林)，但具有非常好的电子密度。只有两个残基被标记为无序的(蓝色)，Ser-18和Cys-26。有四个残基缺少密度(红色)。Lys-91在两种结构中的密度都很低(图19)。

这是对赖氨酸-61残基的正交Rnase和3RN3的电子密度的比较

3 rn3

不出所料，3RN3[5]结构的电子密度总体质量远低于正构RNase a。其中一个残基His-119具有双构象(Green)。22个残基被指定为红色，它们的密度缺失。其余的被归为白色，问题很少。

正交RNase A的活性位点的电子密度

如前所述，以下残基被认为最有可能参与活性位点机制:Lys-1 (R)， Lys-7 (W)， Gln-11 (W)， His-12 (W)， Lys-41(R)， Asn-44 (W)， Thr-45 (W)， Lys-66(G)， His-119 (W)和Ser-123 (G)。考虑到它们的电子密度特性，似乎有理由从这个列表中忽略:Lys-1 (R)， Lys-41(R)， Lys-66(G)和Ser-123 (G)。然后列表变成:Lys-7 (W)、Gln-11 (W)、His-12 (W)、Asn-44 (W)、Thr-45 (W)和His-119 (W)与组一起紊乱到A位点(60%)和B位点(40%)。

总体评论

图18中标记为红色的两个残基对这两个结构都是共有的，它们缺少密度或无序。这些是Lys-1和Gln-28。在正交RNase A中，有4个赖氨酸残基是红色或绿色的，而在3RN3中有9个[5]。如图19a所示，在正交RNase A的情况下，Lys-61具有完整而清晰的电子密度，而3RN3的电子密度图(图19b)显示不存在Cε和Nξ。在正交RNase A中，Lys-61的侧链是完全延长的，而在3RN3中，它是卷曲的。

在Lys-91的情况下，图20a, b，这两种结构的电子密度都很弱，使得很难将这部分结构建模为x射线模型。幸运的是，这可能是这类研究中唯一一个给出如此多问题的例子。

这是对残基赖氨酸-91的正交Rnase和3RN3的电子密度的比较

例如，通过分子动力学计算，有可能使这些差异合理化。

水晶包装

将正交RNase A的分子结构与单斜rn3的分子结构进行了比较。比较两者的晶体包装也是有意义的。蛋白质取向的差异表现为蛋白质-蛋白质相互作用的差异。利用PDBe PISA v1.52[20/10/2014]在EBI Web服务器上研究了正交结构7P4R和单斜结构3RN3与邻近蛋白分子的相互作用。结果可以在附加文件1:表S4中找到。

部分和溶剂化乙醇分子在正交RNase A

在0.85Å正构RNase A结构中，分别找到了SO41151 ~ 1155和EOH A201 ~ A211的5个片段和11个乙醇分子。氢原子最初通过Biovia以几何方式插入EtOH分子中[19]。SO41152和SO41153中的两个部分被打乱并精炼成A和b两种构象，如图21所示，这12种溶剂化物中的大多数位于或靠近结构的分子间含水区域。图22、23、24、25、26、27、28给出了一些例子。我们已经看到:(i)图5a中的活性位点A (SO41152A)，并注意到它通过两个水分子连接到蛋白质主链上;(ii)图6a中的活性位点(SO41152A和B)以及A位点与His-12、Gln-11和一个水分子的链接，以及B位点与Gln-11和同一个水分子的链接;，详情见图6。图8c为硫酸SO41154与α -螺旋III的氢键，图9b、c为硫酸SO41152通过水分子与α -螺旋I和乙醇EOH1164的氢键。

乙醇和硫酸盐分子在正异性核糖核酸酶A中的分布:S51为SO41151等，E201为EOH A201等。SO41152是活性位点硫酸盐，在A(60%)和B(40%)两部分无序。SO41153在A(50%)和B(50%)两部分也存在紊乱。乙醇分子都井然有序。硫酸盐和乙醇分子都主要位于分子的外部区域

SO41151连接到Gly-112和几个水域

SO41153与Ser-22和Ser-23以及几种水的氢键

SO41155与Ser-89和几种水形成复杂的网络。

SO41153与Ser-22、Ser-23、EOH A204和几种水的氢键

EOH a208通过一个水分子与Gln-101连接

显示EOH, a205氢与水分子成键

序列Ala-20至Ser-23与乙醇分子EOH A 202和EOH A 204相互作用

图22、23、24、25、26、27和28是这些溶剂化物与蛋白质残基之间相互作用的示例。这些相互作用似乎达到了某种程度的稳定。

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