摘要

背景

据推测，疟原虫的核糖体RNA基因是根据一种生灭模式进化的，新的变异是由复制产生的，而其他的变异则被删除。对于某些疟原虫物种，已经证明18S rRNA基因的不同变体在脊椎动物宿主和蚊子载体中表达差异。本研究的主要目的是评估Haemoproteus属的禽嗜血杆菌寄生虫是否也具有明显不同的18S变异，重点研究了Haemoproteus majoris和Haemoproteus belopolskyi种群的谱系。

方法

对古北地区传目鸟类中常见的19个副血红蛋白亚属的18S rRNA基因进行了测序。对含19个寄生虫谱系的20份血液和组织样本进行分子克隆，平均每个克隆10个。分析了序列特征，并计算了系统发育树，包括先前发表的另外8个副血红蛋白谱系的序列数据。所有27个谱系的地理和宿主分布被可视化为CytB单倍型网络和饼状图。基于18S序列数据，设计了物种特异性的寡核苷酸探针，通过原位杂交技术定位宿主组织中的寄生虫。

结果

大多数嗜血杆菌谱系像许多疟原虫一样有两个或更多的18S基因变体，但变体之间的最大距离通常较低。此外，与大多数哺乳动物和鸟类疟原虫不同，除了一个寄生虫谱系外，所有寄生虫的18S序列都聚集成相互的单系进化枝。只有在塔塔科夫斯基嗜血杆菌hSISKIN1和嗜血杆菌hROFI1中发现了明显不同的18S聚集。嵌合18S变体在某些嗜血杆菌谱系中的存在表明，它们的核糖体单位以半协调的方式进化，而不是根据严格的生与死进化模型。

结论

副变形原虫亚属的寄生虫含有明显的18S变异，但种内变异性低于大多数哺乳动物和鸟类疟原虫。新的18S数据为利用针对特定寄生虫谱系的原位杂交技术更深入地研究宿主组织中嗜血杆菌寄生虫的发展提供了基础。

背景

核糖体rna构成核糖体的核心部分，是所有细胞中蛋白质合成所必需的。真核生物的核糖体单元包含18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因，由内部转录间隔物ITS1和ITS2分开。5S rRNA基因位于不同的基因组区域。18S rRNA是小核糖体亚基(SSU)的一部分，28S rRNA、5.8S rRNA和5S rRNA是大核糖体亚基(LSU)的一部分。大多数真核生物的核糖体单元在一个或几个染色体上以串联重复序列的簇排列，其中每个簇包含核糖体单元的多个拷贝。由于功能的限制，核糖体rna是真核生物中最保守的基因之一。假设核糖体单位是根据导致均质化的协同进化模型进化的[1,2]。协同进化的机制可能涉及重组、基因复制和染色体间基因转换过程中的不平等杂交[3]。然而，疟原虫的核糖体基因是特殊的，因为它们的核糖体单位被认为是根据一个出生和死亡模型进化的，新的变异是由复制产生的，其他的被删除[4]。对人类和啮齿动物疟原虫18S rRNA基因的研究发现，单个单位的序列差异很大[5]，不同的变体在脊椎动物和蚊子宿主中表达差异[6]。在脊椎动物宿主和蚊虫载体中表达的18S序列分别被命名为a型和s型变异[6,7]。这种模式在啮齿动物、猿类和人类疟原虫(疟疾疟原虫除外)中均有发现，其中a型和s型的差异为10% ~ 17%[8]。

Harl等[8]首次对禽血孢子虫寄生虫核糖体基因进行了全面的研究，对7个疟原虫、9个嗜血杆菌和16个白细胞虫系的18S基因进行了测序。所研究的大多数禽类疟原虫谱系也具有明显的18S变异群，差异高达14.9%。在toddi Leucocytozoon组中也发现了类似的模式，但除了tartakovskyi Haemoproteus外，其他Leucocytozoon和Haemoproteus寄生虫的18S序列变化较少，缺乏高度分化的变异簇[8]。

嗜血杆菌属目前包括大约180个形态学描述的物种，但可获得的分子遗传数据不到一半[9]。MalAvi数据库(http://130.235.244.92/Malavi/;收录于2022年12月)包含超过1500个独特的嗜血杆菌谱系，覆盖了整个或几乎整个478 bp的CytB条形码区域。绝大多数尚未与形态种联系起来，因此，已知的物种只构成物种多样性的一小部分。该属包括血红蛋白亚属和副血红蛋白亚属。血变形亚属寄生虫主要存在于Columbiformes, Suliformes和Charadriiformes的鸟类中，并通过虱蝇(Hippoboscidae)传播。在全球范围内，特别是在北半球，弓形虫亚属的寄生虫在雀鸟中极为多样化，并通过叮咬蠓(蠓科)传播。

本研究对19个嗜血杆菌谱系的18S rRNA基因进行了测序。目前所研究的谱系中约有一半与主要嗜血杆菌(hCCF5, hCWT4, hEMSPO03, hPARUS1, hPHSIB1和hWW2)和belopolskyi嗜血杆菌(hACDUM2, hARW1, hMW3和hSW1)群有关，其中包括古北飞禽中一些最常见的禽类嗜血杆菌谱系。此外，还对balmoproteus hCOLL3、fringillhaemoproteus hCCF3、Haemoproteus sph rofi1、Haemoproteus核浓缩Haemoproteus hGRW01、Haemoproteus parabelopolskyi hSYAT02、Haemoproteus payevskyi hRW1、Haemoproteus cfg magnus hCCF6以及尚未连锁的谱系hCCF2和hCWT7进行了18S序列测序。Harl等[8]先前发表的8个haemproteus谱系序列被纳入分析。

主要的问题是，禽类嗜血杆菌寄生虫是否像许多疟原虫一样具有不同的18S变异簇，这表明它们的核糖体基因在鸟类宿主和双翅目媒介中也可能存在差异表达。此外，核糖体基因构成细胞中RNA分子的很大一部分，因此是分子遗传学方法(如原位杂交测定)的合适靶标。18S序列是设计物种/谱系特异性寡核苷酸探针的基础，可用于寄生虫的组织学切片定位和共感染中寄生虫的区分。

方法

样品采集和制备

本研究对古北地区雀形鸟中发现的19个嗜血杆菌谱系的18S rRNA基因进行了测序。这些样本是维尔纽斯自然研究中心(立陶宛)和维也纳兽医大学病理学研究所(奥地利)收藏的一部分。2018年至2021年期间，在立陶宛ventkicape的鸟类学站使用固定陷阱(大型“Rybachy”型，之字形和漏斗陷阱)和雾网收集野生鸟类，并在刺穿臂静脉后用肝素化微血管采集血液样本。用新鲜的血滴在滤纸上形成血点用于DNA分析，在玻片上形成血膜用于显微镜检查。将血膜在绝对甲醇中固定1分钟，然后用10% Giemsa染色[10]。通过显微镜检查对血膜进行分析，并根据许可对60只高寄生虫血症的鸟进行斩首安乐死(见伦理声明)。如上所述，2018年在生物站Neusiedler See (Illmitz, Burgenland)的常规鸟类鸣叫期间，从两只鸟(AH1663和AH1664)身上采集了血液样本。组织样本(肝脏)取自一只死鸟(AH2023)，于2020年提交给病理学研究所(Vetmeduni Vienna)进行公民科学研究[11]，并在- 80°C保存以进行DNA分析。死鸟器官标本用福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)，保存在维也纳病理研究所(Vetmeduni Vienna)的组织标本中。立陶宛样本的代金券血膜存放在自然研究中心。使用dnasy血液和组织试剂盒(QIAGEN, Venlo，荷兰)从滤纸上的血斑或冷冻肝组织中分离DNA。按照制造商的方案从组织中分离DNA，但从同一柱中制备两种洗脱液，每种洗脱液100 μ l，第一种洗脱液8000 rpm，第二种洗脱液13000 rpm。第二种洗脱液用于pcr。本研究所分析样本的资料载于表1。该表还包括[8]所研究样本的信息，他们之前发表了8个副嗜血杆菌谱系的18S序列。

CytBPCR引物

采用[12]描述的巢式PCR方法获得了478 bp的细胞色素B (CytB)基因片段，这是禽血孢子虫寄生虫常见的DNA条形码序列。在第一次PCR中使用引物HaemNFI (5 ' -CAT ATA TTA AGA GAA NTA TGG AG-3 ')和HaemNR3 (5 ' -ATA GAA AGA TAA GAA ATA CCA TTC-3 ')，巢式PCR中分别使用HaemF (5 ' -ATG GTG CTT TCG CTT GCA gct GGA TGT GAT AAT GGT-3 ')/HaemR2 (5 ' -GCA TTA TCT GGA TGT GAT AAT GGT-3 ')和HaemFL (5 ' -ATG GTG TTT TAG ATA CTT ACA TT-3 ')/HaemR2L (5 ' -CAT TAT CTG GAT GAG ATG GNG C-3 ')[12]。利用引物CytB_HPL_intF1(5′-GAG AAT TAT GGA GTG GAT GGT G-3′)和CytB_HPL_intR1(5′-ATG TTT GCT TGG GAG CTG TAA TC-3′)[8]获得885 bp的CytB片段，用于计算系统发育树。

18岁PCR引物

为了扩增haemproteus谱系的几乎整个18S rRNA基因，我们使用了引物18S_H_1F (5 ' -TGG TTG ATC TTG CCA GTA ATA TAT GT-3 ')和18S_H_1R (5 ' -CGG AAA CCT TGT TAC GAC TTTTG-3 ')，它们分别位于18S的5 '端和3 '端22 bp处[8]。由于部分Haemoproteus谱系的18S序列不重叠，设计了Haemoproteus特异性引物18S_H_int_F(5’-AGA TCA AGT TGA AGT GCC AGC at -3’)和18S_H_int_R(5’-CGT TAA ACA CGC GAC GTC-3’)，分别位于18S 5’端约550 bp和1700 bp处，对覆盖中间部分的1100 bp区段进行测序。后一种引物仅针对Parahaemoproteus亚属的18S rRNA基因，而不针对遗传高度分化的Haemoproteus亚属的18S rRNA基因[8]。

pcr和分子克隆

针对478 bp CytB条形码片段的pcr遵循[12]的方案，使用GoTaq®G2 Flexi DNA聚合酶(Promega, Wisconsin, Madison, USA)进行。pcr首先在94°C下进行2分钟的初始变性，随后进行35次循环，94°C下30秒，50°C下30秒，72°C下1分钟，最后在72°C下延长10分钟。在两个嵌套pcr中，每1µl第一个pcr产物作为模板。针对885 bp CytB片段的PCR使用GoTaq®Long PCR Master Mix (Promega, Wisconsin, Madison, USA)进行。pcr首先在94°C下进行2分钟的初始变性，然后在94°C下进行30秒、55°C下进行30秒、68°C下进行2分钟的35次循环，最后在72°C下延长10分钟。针对18S序列的PCR在相同条件下使用GoTaq®Long PCR Master Mix进行扩增，扩增时间为2 min。为获得足够的PCR产物，进行直接测序和分子克隆。PCR产物在1% LB琼脂糖凝胶上可视化，并送往Microsynth Austria GmbH (Vienna, Austria)，使用PCR引物进行纯化和双向测序。

然后对18S PCR产物进行进一步处理，并进行分子克隆，如[8]所述。每20µl pcr产物在1% LB琼脂糖凝胶上运行，用火焰刮刀切除条带。使用QIAquick凝胶萃取试剂盒(QIAGEN)按照标准方案纯化凝胶带，并用20µl蒸馏水洗脱。使用TOPO™TA Cloning™Kit (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)，使用pCR™4-TOPO®载体和One Shot®TOP10受质细胞进行克隆。结扎转化后，将大肠杆菌细胞在37℃下于SOC培养基中回收1 h，涂于LB琼脂板上，37℃下培养20 h。从每个克隆实验中，用灭菌(火焰)牙棒挑选15至20个个体克隆，并转移到新鲜LB琼脂板上。将含有剩余大肠杆菌的同一牙棒放入pcr管中，加入25µl用于集落pcr的主混合物。在与18S PCR相同的条件下(见上文)，使用GoTaq®Long PCR Master Mix (Promega)进行菌落PCR，但使用引物M13nF (5 ' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT GA-3 ')和M13nR (5 ' -GAC CAT GAT TAC GCC AAG CTC-3 ')[8]。最多15个克隆的pcr产物携带预期大小的插入物，送往Microsynth Austria GmbH (Vienna, Austria)进行纯化和测序，使用集落pcr引物。

原始序列数据分析

在BioEdit v.7.0.8.0软件[13]中手动对CytB和18S序列的正、反向读段和电泳图进行比对和肉眼检查。然后使用MAFFT v.7[14]，使用默认选项(FFT-NS-2)对序列进行比对和排序，从18S比对中剪切引物和克隆载体序列。由于部分18S克隆不重叠，用引物18S_H_int_F和18S_H_int_R对65个克隆的中间部分进行了重新测序。利用MAFFT v.7对长、短18S序列进行组合和重组。并在相应的电泳图中重新检查所有异常位置。

CytB单体型网络

为了可视化主要人种和belopolskyi人种的地理和寄主分布，我们计算了两个DNA单倍型网络。这两个群体的CytB谱系聚集在相互的单系分支中，目前包含21个(H. majoris)和40个(H. belopolskyi)谱系，其中大多数尚未与形态种联系起来。根据MalAvi数据库(http://130.235.244.92/Malavi/index.html)中列出的所有完整的haemproteus谱系和NCBI GenBank中提供的其他一些谱系，通过计算最大似然(ML)树来确定进化支。序列与MAFFT v.7进行比对。[14]应用默认选项(FFT-NS-2)，并且由于在某些序列中错误或不完整，第一和最后两个bp被修剪。使用IQ-TREE v.1.6.12计算ML bootstrap树(1000个重复)。[15]采用GTR+F+I+G4替代模型，基于裁剪后的474 bp比对(1325个独特的谱系)。对于H. majoris和H. belopolskyi分支中包含的每个谱系，宿主、国家和参考文献的信息从MalAvi“宿主和站点”表(http://130.235.244.92/Malavi/)中提取，并在Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA)表格中组织。此外，还增加了一些仅在NCBI GenBank上可用的谱系的序列和相关信息。使用Network 10.2.0.0 (Fluxus Technology Ltd, Suffolk, UK)使用默认设置计算中位加入单倍型网络。这些网络以图形方式排列，并根据网络出版商v.2.1.2.5 (Fluxus Technology Ltd)的联合国地理计划提供关于宿主物种/科和地理区域的信息。为了显示其他谱系的地理和主机分布，我们基于MalAvi的“主机和站点”数据，用Microsoft Excel创建了饼状图。所有图形都是用Adobe Illustrator CC v.2015完成的(Adobe Inc.， San josise, CA, USA)

系统发育树

对CytB和18S数据集计算ML和贝叶斯推理(BI)树。基于本研究获得的19个MalAvi谱系和[8]发表的8个谱系的885 bp序列，计算CytB树。matutinum pLINN1 (MT912161)序列作为外群。IQ-TREE v.1.6.12建议的最佳拟合替代模型。[15]根据修正后的赤池信息准则(Akaike Information Criterion, AICc)为GTR+F+I+G4。使用IQ-TREE v.1.6.12计算ML引导树。[15]通过执行10,000次自举复制。BI树采用MrBayes v.3.2计算。[16]。分析运行了500万代(每次运行2次，有4条链，其中一条是加热的)，并对每千棵树进行采样。前25%的树被作为老化而丢弃，从剩余的3750棵树中计算出50%的多数决原则共识树。

18S序列比对包含本研究获得的19个MalAvi谱系201个无性系和[8]发表的7个MalAvi谱系71个无性系。13个克隆被排除在分析之外，因为它们起源于合并感染中的其他谱系。来自[8]的样本AH0002H (hRB1)的18S序列也被排除，因为它们在5 '端缺少一个115 bp的片段。序列与MAFFT v.7进行比对。[14]使用选项G-INS-I(基于Needleman-Wunsch算法的全局对齐)。为了减少序列数量，每个MalAvi谱系(共74个序列)选择2至5个不同克隆的亚群。由于其他血孢子虫属的18S序列与副血孢子虫属的18S序列存在较大差异，因此未纳入外群，而移除间隙位置会导致信息丢失。用MAFFT v.7对序列子集进行重新对齐。(G-INS-I选项)，得到2526 bp的比对结果。在AH1982 (hCOLL3)和AH1895 (hSYAT02)(通过直接测序获得)和AH0608 (hEMCIR01;[8])。在修整后一个地点后，这条路线有2443个位置。用trimAl v.1.2去除所有含有间隙的位点后。[17]，最终对齐有1605个位置。IQ-TREE v.1.6.12建议的最佳拟合替代模型。[15]根据修正后的赤池信息准则(Akaike Information Criterion, AICc)为TVM+F+I+G4。由于后一种模型没有在MrBayes v.3.2中实现。[16]，第二好的模型GTR+F+I+G4被用于ML和BI分析。使用IQ-TREE v.1.6.12计算ML bootstrap和BI树。[15]和MrBayes v.3.2。[16]使用与推断CytB树相同的参数。

序列比较和重组测试

在序列分析之前，将每个MalAvi谱系的18S克隆放在单独的文件中，以确定序列的最小和最大长度。利用Microsoft Excel计算MalAvi各谱系18S序列的平均gc含量。每个MalAvi谱系的序列分别与MAFFT v.7进行比对。[14]使用选项G-INS-I，并使用MEGA X v.10.0.5计算变体之间的最大p-距离[18]。后一种比对也用于检验来自同一MalAvi谱系的不同18S克隆是否表现出嵌合特征，从而表明来自同一MalAvi谱系的不同18S变体之间存在重组。RDP5 v.5.3。使用[19])进行以下重组测试:RDP[20]、Bootscan[21]、GENECONV[22]、Maxchi[23]、Chimaera[24]、SiSscan[25]、3Seq[26]。

原位杂交探针的设计

根据所有haemproteus 18S序列的比对，设计了专门针对所研究谱系的寡核苷酸探针。用目测来确定探针结合的合适区域。大多数探针被放置在特定于每个MalAvi谱系的可变序列区域。探针质量用AmplifX v.2.0.7 (Nicolas Jullien, Aix-Marseille university, CNRS, INP，马赛，法国;https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr)。所有探针都在NCBI GenBank中针对顶复合体寄生虫和鸟类基因组进行blast，以排除无意结合。

目录

摘要 背景 方法 结果 讨论 结论 数据和材料的可用性 缩写 参考文献 致谢 作者信息 道德声明 补充信息 搜索 导航 #####

结果

对19个副嗜血杆菌系的18S序列进行了分析，其中一半属于H. majoris和H. belopolskyi类群。将[8]发表的7个嗜血杆菌谱系的18S序列纳入统计分析和系统发育树。

CytB单体型网络

为了可视化属于H. majoris和H. belopolskyi群体的CytB谱系的地理和宿主分布，基于474 bp的DNA单倍型网络计算包含所有谱系聚类在两个分支中的数据。

H. majoris进化支包括21个独特的谱系，在474 bp CytB序列中差异高达9 bp(图1)。除了hPOEATR01、hTUMIG08、hTUMIG21和hPHYBOR04主要来自北美画眉外，大多数谱系主要存在于欧洲和西亚的鸣禽中，偶尔也存在于北非和南亚。根据MalAvi数据库(http://130.235.244.92/Malavi/)，以下六个谱系由[27,28]归属于H. majoris: hCCF5, hCWT4, hPARUS1, hPHSIB1, hPHYBOR04和hWW2。除hPHYBOR04外，其他所有谱系均获得了18S序列，因为唯一可用的样本DNA含量不足。hPARUS1、hPHSIB1和hWW2这三个谱系是欧亚鸣禽中最常见的血孢子虫寄生虫谱系。hPARUS1(876份)主要分布在北欧(510份)、西欧(135份)、东欧(104份)、西亚(65份)和南欧(48份);主要寄主是蓝蝇科的蓝蝇(463只)和大蓝蝇(244只)。hPHSIB1(868)主要在北欧(791)和东欧(44)发现;蝇蝇科的Ficedula albicollis(499)和Ficedula hypoleuca(172)是最常见的寄主。hWW2(505)主要分布在北欧(445)，寄主谱更广，约有一半的记录来自Sylviidae(247)，其次是Phylloscopidae(138)、Paridae(55)和Muscicapidae (31);最常见的寄主物种是长叶虫(Phylloscopus trochilus)(108)、Sylvia borin(90)、Sylvia atricapilla(79)和Sylvia communis(64)。hCCF5(36)几乎只在北欧(32)和北非(4)的Fringilla coelebs(35)中发现。hCWT4(22)主要在北欧(8)、东欧(7)和西亚(5)中发现，大部分记录来自Sylviidae(15)，特别是S. communis(8)。hEMSPO03(8)尚未与形态种联系;在西亚(5)、西欧(2)和东欧(1)分别发现于Pyrrhula Pyrrhula(3)和Phylloscopus nitidus(2)等地。来自印度Phylloscopus humei(1)和Phylloscopus trochiloides(3)的hEMSPO03序列记录[29]未被纳入，因为该序列仅覆盖了448 bp的CytB条形码区域。

属于大出血杆菌群的部分(474 bp) CytB序列的中位连接DNA单倍型网络。根据联合国地理分布图，这两幅图显示了A鸟科和B地理区域的分布情况。每个圆圈代表一个独特的单倍型/血统。频率表示所有单倍型都有一个以上的记录，大致对应于圆圈的大小。分支上的条表示两个单倍型之间的替换次数。小的白色圆圈代表中位数向量，这是假设的(通常是祖先的或未采样的)序列，需要将现有的单倍型与最大简约性联系起来。本研究分析的谱系用星号标记

The H. belopolskyi clade included 40 unique lineages differing by up to 38 bp in the 474 bp CytB sequence (Fig. 2). Hence, the distances between some lineages are much higher than in the H. majoris clade. They were almost exclusively found in various species of the family Acrocephalidae (marsh- and tree-warblers) in Europe, Asia, and Africa. According to the MalAvi database (http://130.235.244.92/Malavi/), the following nine lineages belong to H. belopolskyi: hARW1, hHIICT1, hHIICT3, hHIICT4, hHIICT5, hMW1, hRW3, hSW1, and hSW3. However, only HIICT1 and hMW1 were studied morphologically [30], and hHIICT5 (1 bp difference from hHIICT3) does not cover the entire barcode region. The clade also contains the lineage hGRW01, which was linked to H. nucleocondensus by [31], but differs only in 2 bp from H. belopolskyi hMW1. Further taxonomic studies might reveal that the lineages in the H. belopolskyi clade belong to multiple cryptic species. 18S sequences were obtained from the following five lineages: hACDUM2, hARW1, hGRW01, hMW3, and hSW1. hACDUM2 (52 records) was found mainly in Acrocephalus agricola in Eastern Europe (22) and Acrocephalus dumetorum in Southern Asia (22). hARW1 (25) was found in Acrocephalus scirpaceus (12), Acrocephalus palustris (5), and a few other bird species in Northern, Western, and Eastern Europe, Western Asia, and Northern and Eastern Africa. hGRW01 (225) was almost exclusively detected in Acrocephalus arundinaceus (216) throughout its distribution range in Europe (195) and Africa (18), and Western Asia (3). hMW3 (6) was so far only found in A. palustris in Turkey (3) and in the present study in Lithuania (2). hSW1 (171) was mainly detected in Acrocephalus schoenobaenus (158) in Eastern Europe (152), Northern Europe (2), Western Europe (1), Western Asia (2), and Western Africa (1), and in A. scirpaceus (8) in Eastern Europe (3), Southern Europe (2), Western Asia (3), and Western Africa (1). The distributions of the other lineages (hCCF2, hCCF3, hCCF6, hCOLL3, hCWT7, hEMCIR01, hCULKIB01, hLK03, hROBIN1, hROFI1, hRW1, hSISKIN1, hSTAL2, hTURDUS2, and hSYAT02) in bird hosts and geographic areas (UN geoscheme) are shown as pie charts (Fig. 3). Haemoproteus sp. hCCF2 (95 records) was mainly found in Fringilla coelebs (81) in Northern Africa (52), Northern Europe (18), and Southern Europe (16). Haemoproteus fringillae hCCF3 (58) was detected mostly in F. coelebs (31), Carduelis chloris (14), and Pyrrhula pyrrhula (7) in Northern Europe (36), Western Asia (12), Eastern Europe (5), Northern Africa (4), and Southern Europe (1). Haemoproteus cf. magnus hCCF6 (87) was almost exclusively found in F. coelebs (85) in Northern Africa (53), Europe (27), Western Asia (5), and Southern Asia (2). Haemoproteus balmorali hCOLL3 (108) was detected in Ficedula albicollis (76), F. hypoleuca (24), and other Muscicapidae (9) in Northern Europe (56), Eastern Europe (41), Southern Europe (7), Western Asia (2), and Northern Africa (1). Haemoproteus sp. hCWT7 (29) was mostly found in S. communis (26) in Western Asia (24). Haemoproteus syrnii hCULKIB01 (22) was found in the owl species Strix aluco (10), Strix uralensis (9), Bubo bubo (1), and Strix nebulosa (1) in Europe. Haemoproteus dumbbellus hEMCIR01 (47) was almost exclusively found in Emberiza citrinella (40) in Europe. Haemoproteus brachiatus hLK03 (19) was mainly found in Falco tinnunculus (13) and other falcons (2) in Eastern Asia (8), Western Asia (1), and Europe (6). Haemoproteus sp. hROFI1 (61) was mainly found in F. coelebs (22), Carduelis chloris (20), and other Fringillidae species (12) in Northern Europe (38), Northern Africa (16), Eastern Europe (4), and Western Asia (3). Haemoproteus attenuatus hROBIN1 (103) was mostly found in the Muscicapidae species Erithacus rubecula (40), Luscinia luscinia (34), Luscinia megarhynchos (7), and Saxicola rubetra (7) in Europe and Western Asia. Haemoproteus sp. hRW1 (115) was detected in A. scirpaceus (62) and other Acrocephalidae (4), in Cinclus cinclus (24), Lanius meridionalis (16), Luscinia svecica (8), and Cisticola nigriloris (1) in Southern Europe (87), Eastern Europe (12), Northern Europe (11), and other regions (5). Haemoproteus tartakovskyi hSISKIN1 (87) was mostly found in Fringillidae (83) in Central America (37), Northern America (22), and Europe (26). The most common hosts were Haemorhous mexicanus (42), Acanthis flammea (7), Loxia curvirostra (6), Loxia leucoptera (5) in the Americas and Spinus spinus (16) in Europe. Haemoproteus parabelopolskyi hSYAT02 (250) was almost exclusively found in S. atricapilla (246) in Western Europe (103), Southern Europe (69), Eastern Europe (38), Northern Europe (30), Western Asia (8), and Africa (2). Haemoproteus syrnii hSTAL2 (37) was detected in owls in Europe (36) and Northern Africa (1), mainly in Strix aluco (19) and Strix uralensis (15). Haemoproteus minutus hTURDUS2 (170) was found mainly in Turdidae (140) in Europe (92), Western Asia (37), and the Americas (14). Most records originate from Turdus merula (121).

部分(474 bp) CytB序列的中位连接DNA单倍型网络，属于haemproteus belopolskyi群。根据联合国地理分布图，这两幅图显示了A鸟科和B地理区域的分布情况。每个圆圈代表一个独特的单倍型/血统。频率表示所有单倍型都有一个以上的记录，大致对应于圆圈的大小。分支上的条形图和正方形中的数字表示两个单倍型之间的替换次数。小的白色圆圈代表中位数向量，这是假设的(通常是祖先的或未采样的)序列，需要将现有的单倍型与最大简约性联系起来。本研究分析的谱系用星号标记

饼状图显示了根据联合国地理分布图(左)和鸟类宿主(右)在地理区域内的寄生虫谱系分布。

DNA单倍型网络和饼状图中显示的信息汇总在附加文件1:表S1中。

18岁序列分析

在大多数情况下，由于变体的长度不同，需要进行分子克隆来检索18S序列。只有样品AH1895H (hSYAT02)和AH1982H (hCOLL3)没有克隆，因为它们的18S序列在直接测序后是完全可读的。从17个嗜血杆菌谱系的20个样本中克隆出了几乎完整的18S序列。每个样本测序2 ~ 15个克隆(共201个，平均10.1个克隆)。我们打算对每个谱系进行最多15个克隆的测序，但在某些情况下，克隆的产量极低。在201个克隆中，有13个克隆被排除在分析之外，因为它们起源于共感染，[12]在用标准引物对CytB条形码片段测序时未检测到共感染。然而，在某些情况下，在引物CytB_HPL_intF1和CytB_HPL_intR1由[8]或18S克隆获得的885 bp序列中可以看到共同感染。大多数18S克隆可以明确地归属于马拉维谱系之一，因为其他样本具有相同谱系的单一感染。样本AH2168H与hCCF3(6个克隆)、hCCF6(7个克隆)和hCCF5(2个克隆)混合感染，其中仅包括hCCF3克隆;hCCF6克隆被排除，因为AH2153H和AH2154H样品含有相同谱系的单一感染，两个hCCF5克隆被排除，因为序列的中间部分不可读。样本AH1973H与谱系hCCF3(9个克隆)、hCCF5(2个克隆)和hROFI1(1个克隆)共同感染。hROFI1克隆被排除在分析之外，因为样品AH2171H提供了足够的hROFI1谱系克隆，但两个hCCF5克隆被保留，因为它们是该谱系唯一完整的18S序列。样本AH2171H与hROFI1(12个克隆)和hCCF6(3个克隆)共感染;hCCF6克隆被排除在分析之外，因为从样品AH2153H和AH2154H中可以获得足够的hCCF6克隆。此外，样本AH1664H可能包含hSW1和另一个H. belopolskyi谱系的共同感染。样本中有4个克隆(3、5、6、14)与H. belopolskyi hARW1 (AH1903H)和hMW3 (AH1899和AH1902)非常相似，另外7个克隆(2、4、7、8、10、11、12)形成了H. belopolskyi分支中的一个独立分支。前4个克隆可能属于hSW3谱系，该谱系仅在同一宿主物种(A. schoenobaenus)中发现，与hARW1仅相差1个bp(图2)。885 bp CytB片段的电泳双峰与hSW3谱系相匹配，但太微弱而无法明确确认其存在。除了AH1973H、AH2168H、AH2171H和AH1664H外，其他样本很可能含有属于单一寄生虫谱系的18S克隆的单感染。H. majoris hEMSPO03 (AH2023H)的18S序列无法完全检索到，因为它在1660 ~ 1800位点具有poly-A和poly-T动机。18S序列上传到NCBI GenBank，登录号为OR337936-OR338136。线粒体CytB的885 bp切片保存，登记号为OR283176-OR283196。

利用本研究和文献[8]发表的18S和CytB序列计算系统发育树。18S树(图4)，每个MalAvi谱系包含2到5个不同的18S克隆(总共74个序列)，是中点生根的。以885 bp的序列计算CytB树(图5)，并以matutinum pLINN1序列作为根。在两棵树中，更深的节点获得的支持值较低，并且拓扑结构部分不同，但18S树和CytB树具有一些共同的模式。brachiatus H. hLK03、H. minutus hTURDUS2、H. synnii hCULKIB01和H. synnii hSTAL2在树的基部位置居多，而其他谱系聚集在一个分支中，具有较低的(18S);bs/bp = 72/0.76)和中度支持(CytB;bs/pp = 82/0.98)。后一个分支在两棵树上都有四个高度支撑的亚分支。第一个亚枝包括H. dumbbellus hEMCIR01、H. fringillae hCCF3、嗜血杆菌sp. hROFI1、H. tartakovskyi hSISKIN1和嗜血杆菌sp. hCCF2。第二个亚支包括H. balmorali hCOLL3和H. attenuatus hROBIN1。第三个亚支系的特征是H. majoris谱系hCCF5, hPARUS1, hWW2, hCWT4, hPHSIB1和hEMSPO03(尚未连接到形态物种)。第四个亚支包括四个H. belopolskyi谱系hMW3、hARW1、hSW1、hACDUM2、H. nucleoconsus hGRW01，以及H. parabelopolskyi hSYAT02、H. payevskyi hRW1、H. cf. magnus hCCF6和H. sp. hCWT7。大多数世系的18S无性系聚集成相互单系进化枝。然而，如上所述，样品AH1664H的克隆可能属于两个不同的haemproteus谱系(hSW1和hSW3)。

嗜血杆菌18S序列的贝叶斯推理树。大多数节点表示后验概率和最大似然自举值。比例尺表示根据所应用的序列进化模型，每个位点的期望平均替换数。该树为中点根，未使用外群

Haemoproteus CytB序列的贝叶斯推理树(885 bp)。大多数节点表示后验概率和最大似然自举值。比例尺表示根据所应用的序列进化模型，每个位点的期望平均替换数。这棵树是用matutinum pLINN1序列生根的

27个Parahaemoproteus谱系的18S变体之间的p距离从H. lanii hRB1的0.46%到H. tartakovskyi hSISKIN1的20.54%不等(表2)。后一个谱系是例外的，因为它具有两个相似的18S变体和一个高度分化的第三个变体。除该样本外，其他世系18S无性系间的最大p距平均值为1.84%。如上所述，在合并感染中，AH1664H样本的一些克隆可能属于hSW3(未/确认/ied)。当分别测试两个序列簇时，hSW1和hSW3克隆之间的最大p距离较小，分别为1.26和0.73(表2)。

H. minuus hTURDUS2和H. majoris hCCF5的18S序列总长度(包括缺失部分和引物区域)从1943 bp到2278 bp不等。最长和最短18S序列差异最大的是H. tartakovskyi hSISKIN1 (53 bp)和H. fringillae hCCF3 (40 bp);所有27个副嗜血杆菌谱系的平均差异为6.8 bp。H. tartakovskyi hiskin1的GC含量为39.4%，H. synii hSTAL2的GC含量为47.4%;总体平均值为45.2%(表2)。有趣的是，H. tartakovskyi hSISKIN1有3个18S克隆，gc含量为42.7%(图4中的短分支)，7个克隆，gc含量为37.4%(图4中的长分支)。

利用RDP5分别对每个副嗜血杆菌谱系的18S克隆进行了重组信号检测[19]。重组信号在27个研究谱系中的10个中被检测到，包括H. fringillae hCCF3、嗜血杆菌hROFI1、核浓缩H. hGRW01、H. synii hCULKIB01、H. synii hSTAL2、H. tartakovskyi hSISKIN1和H. majoris谱系hCWT4、hPHSIB1、hPARUS1和hWW2(表2)。最强的重组信号在hPHSIB1、hWW2和hCCF3中被检测到，七个测试中的每五个或更多都提供了显著的结果(附加文件2:表S2)。

原位杂交探针

基于包含所有可用的血红蛋白18S序列的比对，设计了针对本研究所研究谱系的18S rRNA的寡核苷酸探针。大多数haemproteus谱系的18S序列具有独特的序列区域，可以用原位杂交的寡核苷酸探针定位(表3)。然而，H. belopolskyi谱系hARW1、hMW3和hSW3的18S序列过于相似，因此设计了一个平行靶向所有三个谱系的探针。为hROFI1世系设计的探针仅针对两种主要变体(C02, C08, C09, C11)中的一种;该探针已经进行了测试，证实了鸟类宿主中的表达(未发表的结果)。探针的长度和退火温度分别为23 ~ 31个核苷酸和54.2℃和68.1℃。大多数探针在AmplifX v.2.0.7中获得了最高(100)的质量分数。

讨论

本研究对19个血红蛋白亚属(Parahaemoproteus)的18S rRNA基因进行了测序。根据H. majoris (hCCF5, hCWT4, hEMSPO03, hPARUS1, hPHSIB1, hWW2)和H. belopolskyi (hACDUM2, hARW1, hMW3, hGRW01, hSW1)种群的形态特征和/或相似的CytB条形码序列，超过一半的这些谱系先前与H. majoris (hCCF5, hCWT4, hEMSPO03, hPARUS1, hPHSIB1, hWW2)和H. belopolskyi (hACDUM2, hARW1, hMW3, hGRW01, hSW1)种群有关联或密切相关。这两个物种群包括在古北极地区的鸣禽中发现的一些最常见的血红蛋白谱系。此外，对其他8个血红蛋白谱系的18S rRNA基因进行了测序:hCOLL3、hCCF2、hCCF3、hCCF6、hCWT7、hROFI1、hRW1和hSYAT02。序列分析纳入了[8]发表的8个haemproteus谱系hCULKIB01、hEMCIR01、hLK03、hROBIN1、hRB1、hSISKIN1、hSTAL2和hTURDUS2的数据。

大多数哺乳动物疟原虫具有两个高度分化的序列集群，每个集群包含一个或两个相似的18S变体。恶性疟原虫、间日疟原虫和伯氏疟原虫的18S变异在脊椎动物宿主(a型)和蚊子载体(s型)中存在差异表达[32,33,34]。间日疟原虫是唯一具有额外o型变异的物种，该变异在卵母细胞和卵囊中表达[33]。另一个例外是疟疾疟原虫，因为它的18S基因几乎相同，不会形成单独的簇。vaughani Plasmodium pSYAT05(9.3%)、matutinum Plasmodium pLINN1(10.8%)和elongatum Plasmodium pGRW06(14.9%)的18S变异间距离也相当高[8]。重组测试在几种疟原虫的18S序列中检测到嵌合特征，这表明不同的变体不是根据强净化选择下的生与死进化模型独立进化的[4]，而是以半协调的方式进化的[8,35]。

所研究的嗜血杆菌寄生虫也具有明显的18S变异，但变异之间的平均最大距离(排除异常的H. tartakovskyi hSISKIN1的平均值为1.84%)明显低于所调查的大多数疟原虫物种。与许多疟原虫物种不同，大多数谱系的18S变体聚集成相互的单系进化枝。AH1664H是一个例外，其18S变异差异为5.64%，属于H. belopolskyi组内的单独分支，然而，后者的样本可能具有H. belopolskyi hSW3和H. belopolskyi hSW1的共同感染(见“结果”)。haemproteus sp. hROFI1具有两个18S变体，差异为7.5%，但它们聚集在一个弱支持的分支中(图4);除了长CytB序列中与hCCF6匹配的双峰外，未发现其他共感染谱系。在H. tartakovskyi hSISKIN1中发现了最特殊的模式，它具有三个18S变体，两个相似的变体相隔6.5%，第三个与后两个变体分别相隔18.3%和20.5%。第3个突变体在序列区域出现了大量的替换(主要是由G/C变为a /T)，这在大多数其他haemproteus谱系中是保守的，因此其gc含量为37.4%，明显低于其他突变体的43.2%和42.4%。这种异常的18S变体可能是无功能的，因此与其他haemproteus 18S rRNA基因拷贝相比，获得了更多的替换。尽管序列差异很大，但这三种变体都聚集在一个支持良好的进化枝中(图4)。Bensch等人发表的H. tartakovskyi hSISKIN1的核基因组序列[36]也包括了异常的第三种变体(PRJNA309868, contig 65)，但只有另外两种变体中的一种(PRJNA309868, contig 602)。所有分析的嗜血杆菌18S序列的平均gc含量为45.2%，显著高于禽疟原虫的34.0%和普通白细胞原虫的37.3%。gc含量仅在今日白细胞群(Leucocytozoon toddi)寄生谱系中较高，为49.3%[8]。在H. minutus hTURDUS2和H. majoris hCCF5中，Haemoproteus 18S序列的总长度从1943 bp到2278 bp不等，比禽疟原虫(2100 ~ 2177 bp)、白细胞原虫(2094 ~ 2138 bp)和toddi白细胞群(2125 ~ 2308 bp)的变异更大。对嗜血杆菌寄生虫谱系的18S序列进行的重组试验也表明，在同一物种或谱系的18S变体之间进行重组可能会产生嵌合特征。结果在物种之间存在差异，例如，在H. belopolskyi组中没有检测到重组18S变体，而在H. majoris组中，5个谱系中有4个具有重组变体。因此，研究结果表明，与Rooney[4]提出的生灭进化模型相比，haemproteus物种的核糖体基因以Corredor和Enea[35]提出的几种疟原虫物种的核糖体基因以半协调的方式进化。Corredor和Enea[35]使用了“半协同进化”一词，因为他们发现疟原虫的一些(但不是全部)18S rRNA基因拷贝是协同进化的，因此需要某种形式的序列相互作用(转换)，而不是不平等杂交。相比之下，大多数真核生物的核糖体基因以完全协调的方式进化，导致单个基因拷贝的均质化[3]，涉及重组、基因复制和染色体间基因转换过程中的不平等交叉等机制[1,2,37]。另一方面，出生和死亡进化模型假设免疫系统中涉及的多基因家族，如免疫球蛋白和主要组织相容性复合体(MHC)，不会以协调一致的方式进化;新的拷贝源于基因复制，而其他的则随着时间的推移而失去功能并被删除[38,39]。

18S rRNA基因已被用作顶复合体寄生虫筛选和确定其系统发育关系的标准参考序列。然而，由于存在明显的变异和重组，长插入/缺失，以及属/亚属之间的gc含量存在强烈差异，血孢子虫寄生虫的18S序列不适合作为系统发育标记，而其他类群(如Eucoccidiorida, Piroplasmorida和Eugregarinorida)大多具有相同且更保守的核糖体基因拷贝。因此，人类疟原虫的PCR筛选试验只针对18S的一种主要变异[40,41]。最近的方法甚至建立了定量反转录PCR (qRT-PCR)来直接靶向18S rRNA，从而获得更高的灵敏度[42,43]。这些方法在筛选人类疟原虫感染时是实用的，因为它们只包含四个物种，但在筛选野生鸟类的血孢子虫寄生虫时不太适用，因为它们包含的物种数量要多得多，获得它们的18S序列将需要分子克隆或使用下一代测序方法。

然而，18S和其他核糖体RNA基因，分别是相应的核糖体RNA，是非常有用的目标，用于原位杂交检测标记宿主组织中的寄生虫。这为鸟类血变过程中针对某些寄生虫物种/谱系的病理学研究开辟了新的视角，血变可以显著损害鸟类的各种器官，但仍未得到充分的研究[44,45]。与其他靶序列相比，其主要优点之一是每个细胞含有大量核糖体，从而具有更高的灵敏度。此外，核糖体rna比其他rna稳定得多，这在分析非新鲜材料制备的病理样本时尤为重要[46]。已经建立了用于原位杂交的属特异性寡核苷酸探针，用于靶向和区分鸟类组织中的禽疟原虫、嗜血杆菌和白细胞虫寄生虫[47,48]。一种疟原虫特异性探针成功地检测了圈养企鹅和野生帕西原虫鸟石蜡包埋器官的血液和组织阶段，结果表明疟原虫的组织阶段在两组中都能导致死亡[47,49]。显色原位杂交测定也被用于表征猴形猛禽[50]、兽形猛禽[51]、画眉[52]和其他鸣禽[11]的组织斑点。后一项研究提供了关于宿主组织中红细胞外寄生虫阶段发展的有价值的信息。例如，将组织学方法与原位杂交相结合，首次报道了synii血红蛋白hSTAL2中存在巨噬细胞，并在Leucocytozoon sp. lSTAL5中发现了一种新的外红细胞发育模式[51]。新的Haemoproteus 18S序列和寡核苷酸探针可用于特异性靶向宿主组织中的某些寄生虫谱系/物种。当样本中含有共同感染时，这种方法尤其重要，并且仍然是唯一可用的方法，这种方法在野生动物中占主导地位。

结论

本研究对古北地区鸟类最常见的血寄生虫Parahaemoproteus亚属19个血寄生虫谱系的18S rRNA基因进行了测序，重点研究了H. belopolskyi和H. majoris种群。Harl等[8]先前发表的另外8种Haemoproteus的18S序列也被纳入分析。为了显示所调查谱系的地理和宿主分布，我们根据MalAvi数据库中的CytB数据制作了DNA单倍型网络和饼状图。与大多数疟原虫一样，嗜血杆菌谱系也具有两个或多个18S变体，但相同谱系变体之间的种内距离通常较低。此外，除了一个疟原虫谱系外，所有疟原虫的18S序列都聚集成相互的单系进化枝，而大多数哺乳动物和鸟类疟原虫则不是这样。超过三分之一的haemproteus谱系的18S变体中嵌合特征的存在表明，它们的核糖体单位以半协调的方式进化，而不是根据严格的生与死进化模型。基于对18S序列的比对，设计了寡核苷酸探针，利用显色或荧光原位杂交方法特异性定位宿主组织中的寄生虫种/谱系。这将允许检测某些寄生虫谱系，甚至在有共同感染的样本中，这在鸣禽中非常常见。

补充信息

Additional文件1:表S1。

用于DNA单倍型网络的CytB序列数据和饼状图显示了血红杆菌谱系在鸟类宿主和地理区域的分布。

Additional文件2:表S2。

分析血红蛋白谱系18S序列的RDP5重组试验结果。

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